痛经滴丸的主要药效学研究

范自全， 周明眉*， 邱明丰， 郭 孜， 陈 丽

(1.上海中医药大学中医方证与系统生物学研究中心，上海市教委中医内科E研究院，上海201203;2.上海交通大学药学院，上海200240)

痛经是青春期妇女的常见病之一，其中以无器质性病变，与激素释放和植物神经紊乱有关的原发性痛经为多见。中医认为痛经主要是由于血瘀停滞、瘀阻胞宫、胞脉，使经行滞涩，不通则痛。治疗上以理气活血、行瘀止痛为治则。痛经滴丸由常用妇科中药当归、温中中药肉桂、止痛中药延胡索组成，处方功效、主治为温通经脉、活血祛瘀、行气止痛，用于由寒凝血瘀、气滞血瘀所致的妇女痛经。本实验参照《中药新药研究指南》，进行了以痛经为主要适应症的药效学研究，考察痛经滴丸对热板、醋酸扭体等小鼠疼痛模型、小鼠耳肿胀等炎症模型、小鼠痛经模型以及未孕大鼠的在体子宫的影响，以期为临床应用提供参考。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物 昆明种小鼠，体质量18～22 g，雌性SD大鼠，体质量220～250 g，由中国科学院上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物合格证号:SCXK(沪)2007-0005，饲养于上海中医药大学实验动物中心，设施使用许可证:SYXK(沪)2009-0069，室内温度20～25℃，相对湿度40% ～70%，12 h循环照明。

1.2 药品及试剂 痛经滴丸由上海交通大学药学院邱明丰副教授提供，每 1.47 g滴丸粉相当于生药 36 g，批号20100824;痛经宝颗粒，河南省宛西制药份有限公司出品，批号100512。

苯甲酸雌二醇(上海通用药业股份有限公司，批号090502);缩宫素注射液(上海第一生化药业有限公司委托上海信谊金朱药业有限公司生产，批号091062);氯化钠注射液(0.9%氯化钠，安徽双鹤药业有限责任公司，批号100119);冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司，批号T20080108);二甲苯(国药集团化学试剂有限公司，批号F20060419);戊巴比妥钠(上海化学试剂厂分装产品，批号WS20090520)。实验所用试剂均为分析纯。

1.3 实验仪器 BS124S型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);YLS-6B型智能热板仪(山东省医学科学院设备站);RM6240B型生理实验系统(成都仪器厂);JZJ01H型肌肉张力换能器(成都仪器厂)。

2 给药剂量与数据处理方法

2.1 给药剂量与方法 痛经滴丸的高、中、低剂量分别为12、6、3 g/kg(分别相当于60 kg成人每1 kg日用量的20倍、10倍和5倍)，选用痛经宝颗粒作为阳性对照药，给药剂量为7.5 g/kg(相当于60 kg成人每1 kg日用量的20倍)，试验药品均以蒸馏水溶解后给药，痛经模型组给予相同容量的蒸馏水。

3 方法与结果

3.1 痛经滴丸对热刺激致小鼠疼痛的影响［3］取昆明种雌性小鼠，使用智能热板仪重复测定小鼠正常痛阈值两次，选取基础痛阈在5～30 s之间的50只小鼠，按痛阈值随机分为正常对照组，痛经滴丸高、中、低剂量组和痛经宝颗粒组，每组10只。按2.1项方法灌胃给药，每天1次，连续5 d。于末次给药后60 min测小鼠痛阈值，比较组间差异，结果见表1。

表1 痛经滴丸对热刺激致小鼠疼痛的影响 (±s，n=10)

表1 痛经滴丸对热刺激致小鼠疼痛的影响 (±s，n=10)

注:与正常对照组比较，*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01。

/s正常对照 － 17.48 ±5.07 15.17 ±4.29痛经滴丸 12 17.31 ±3.40 20.18 ±4.01*痛经滴丸 6 16.91 ±5.50 19.95 ±4.77*痛经滴丸 3 17.40 ±2.90 19.55 ±3.94*痛经宝颗粒 7.5 17.98 ±5.39 22.25 ±5.98＊＊组别 给药剂量/(g·kg－1)给药前痛阈/s给药后痛阈

表1结果显示，滴丸高、中、低剂量组均有明显提高小鼠热板法痛阈值的作用，与正常组相比，具有显著性差异(P＜0.05)，阳性药痛经宝颗粒的镇痛作用具有极显著性差异(P ＜0.01)。

3.2 痛经滴丸对醋酸致小鼠扭体次数的影响［3-4］取小鼠50只，雌雄各半，体质量18～22 g，称质量标记后将动物随机分为正常对照组、痛经滴丸高、中、低剂量组和痛经宝颗粒组，每组10只。按2.1项所述方法灌胃给药，连续5 d。末次给药后1 h，腹腔注射0.7%醋酸溶液0.2 mL/只，观察并记录注射醋酸溶液后各组小鼠30 min内出现扭体反应(腹部收缩内凹、伸展后肢、臀部抬高、蠕行)的次数，比较各组差异，评价药物的镇痛作用。结果见表2。

表2 痛经滴丸对醋酸致小鼠扭体次数的影响(± s，n=10)

表2 痛经滴丸对醋酸致小鼠扭体次数的影响(± s，n=10)

注:与正常对照组比较，*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01。

组别 给药剂量/(g·kg－1) 扭体次数/(次·30 min－1)正常对照28.1 ±11.8痛经滴丸 12 15.8 ±7.7＊＊痛经滴丸 6 17.7 ±7.9*痛经滴丸 3 20.6 ±13.2痛经宝颗粒 7.5 15.6 ±5.2－＊＊

表2结果表明，痛经滴丸具有较强的镇痛活性，而且呈现出剂量依赖性关系，当剂量为12 g/kg时，对醋酸致小鼠扭体的镇痛效果具有极显著性统计学意义(P＜0.01)，中剂量6 g/kg具有明显镇痛作用(P＜0.05);阳性对照药痛经宝颗粒7.5 mg/kg也显示出较强的镇痛活性(P＜0.01)。

3.3 痛经滴丸对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响［1，3］取昆明种小鼠50只，雌雄各半，按体质量随机分为5组，每组10只。分别灌胃给予痛经滴丸及痛经宝颗粒。末次给药后1 h，于小鼠右耳两面涂二甲苯30 μL/只致炎。2 h后处死动物，取左右耳相同部位的圆片，以左右耳片质量之差作为肿胀度，比较各组间差异。见图1。

图1 痛经滴丸对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用以耳肿胀度进行评价，结果如图1所示，发现痛经滴丸12 g/kg能够极显著地抑制

二甲苯所致小鼠耳急性炎性肿胀(P＜0.01)，6、3 g/kg均能明显抑制二甲苯所致小鼠耳急性炎性肿胀(P＜0.05);痛经宝颗粒7.5 g/kg能极明显地抑制二甲苯所致小鼠耳急性炎性肿胀(P ＜0.01)。

3.4 痛经滴丸对缩宫素致痛经小鼠模型的影响［2］取昆明种雌性小鼠60只，称质量标记后随机分为正常对照组，痛经模型组，痛经滴丸高、中、低剂量组和阳性药组，每组10只。以苯甲酸雌二醇和缩宫素制造原发性痛经模型。按10 mg/kg腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液，连续5 d，以增加子宫平滑肌对药物的敏感性。同时按2.1项灌胃给药，于末次给药后1 h，腹腔注射催产素30 U/kg，以扭体反应为子宫强烈收缩的指标，记录注射后30 min内小鼠的扭体发生率及次数，结果见表3。

表3 痛经滴丸对缩宫素所致小鼠疼痛扭体的影响 (± s，n=10)

表3 痛经滴丸对缩宫素所致小鼠疼痛扭体的影响 (± s，n=10)

注:与模型组比较，*P ＜0.05。

组别 剂量/(g·kg－1)扭体发生率/%扭体次数/(次·30 min－1)正常对照组 －00模型组 － 100 24.3±11.8痛经滴丸 12 80 11.9 ±8.1*痛经滴丸 6 90 13.6 ±12.7*痛经滴丸 3 90 15.5 ±9.5痛经宝颗粒 7.5 100 13.8 ±11.5*

表3结果显示，与正常组比较，模型组小鼠30 min内扭体反应次数和扭体反应发生率明显增多，正常组扭体发生率和次数均为0，可能是缩宫素对未经雌化的子宫效果不明显。与模型组相比，痛经滴丸高、中剂量组使小鼠扭体反应次数均明显降低(P＜0.05);痛经滴丸高、中、低剂量组动物扭体反应发生率也有所降低。

3.5 痛经滴丸对大鼠在体子宫平滑肌的影响［5-7］取成年未孕正常雌性SD大鼠48只，随机分为正常对照组、模型组、痛经滴丸高、中、低剂量组和阳性药组，每组8只。实验前腹腔注射苯甲酸雌二醇8 mg/kg，连续3 d，以促其处于动情前期或动情期，提供子宫对药物的敏感性。实验前禁食12 h，次日各组按2.1项方法给药，模型组给予等体积蒸馏水。给药后1 h，戊巴比妥钠麻醉，取仰位固定于手术台，下腹部剪毛，做一切口分离显露子宫，分离右侧子宫卵巢端及阴道端，中间用缝合线连接肌张力换能器，待曲线收缩平衡后，记录其10 min内的平均张力(g)和收缩频率(次/10 min);然后经静脉注射缩宫素1.0 U/kg，待稳定后，记录其10 min内的平均张力(g)和收缩频率(次/10 min)，结果见表4。

表4结果显示，单次给予痛经滴丸后，痛经滴丸各剂量组对正常大鼠在体子宫收缩张力和频率无明显影响(P＞0.05);模型组大鼠子宫平滑肌在加入缩宫素后10 min内的平均张力升高，为给缩宫素前将近4倍，与正常组相比，具有显著性差异(P＜0.01)，痛经滴丸高剂量和痛经宝颗粒均能极显著降低加缩宫素后大鼠在体子宫收缩张力(P＜0.01)，痛经滴丸中剂量和低剂量能够明显降低加缩宫素后大鼠在体子宫收缩张力(P＜0.05);各给药组对加缩宫素后大鼠在体子宫收缩频率无明显改变(P＞0.05)。

表4 痛经滴丸对大鼠在体子宫平滑肌的影响 (± s，n=8)

表4 痛经滴丸对大鼠在体子宫平滑肌的影响 (± s，n=8)

注:与缩宫素组比较，*P＜0.05，＊＊ P ＜0.01。

组别 剂量/(g·kg－1)加缩宫素前 加缩宫素后平均张力/g 频率/(次·10 min－1) 平均张力/g 频率/(次·10 min－1)正常对照0.65 ±0.23 9.12 ±3.40 － －模型组 － 0.74±0.18 9.12±1.13 2.58±0.70 9.00±1.69痛经滴丸 9.6 0.68±0.35 9.12±0.68 1.68±0.82＊＊ 9.25±2.38痛经滴丸 4.8 0.75 ±0.16 10.38 ±0.75 1.86 ±0.44* 10.75 ±2.05痛经滴丸 2.4 0.74 ±0.18 9.62 ±0.74 1.88 ±0.66* 9.50 ±1.41痛经宝颗粒 6 0.63 ±0.05 10.12 ±2.47 1.69 ±0.44＊＊－10.88 ±1.73

4 讨论

痛经多与子宫平滑肌痉挛性收缩、子宫供血不足或子宫炎症有关。痛经滴丸由常用中药当归、肉桂和延胡索三味药组成，是由痛经宝颗粒处方简化而来，具有处方更简化、剂型更优化的特点。目前此三味药的配伍处方仅见相关临床应用报道［8-10］，尚无确切治疗痛经的药理学实验数据可查;市场上现有治疗痛经药物有限，其中“月月舒”痛经宝颗粒为河南宛西制药厂出品，被认定为“中国中药名牌”产品，产品国内市场的覆盖率为98%，综合市场占有率达到11.98%［11］，这也决定了进行痛经滴丸研发具有实际应用价值。

热板法和醋酸扭体法分别为物理性和化学性镇痛模型，后者是一个研究内脏疼痛的模型，广泛用于中枢和外周疼痛的研究，有报道［12］显示前列腺素的生物合成在疼痛模型的疼痛机制中具有重要作用。痛经滴丸对疼痛模型的作用提示其对于前列腺素的合成有影响，相关研究有待进一步开展。Ribeiro等［13］发现醋酸扭体法与腹腔巨噬细胞和柱状细胞相关，有必要进行药物对腹腔巨噬细胞和柱状细胞功能和炎症介质改变的研究。

制备痛经模型的致敏药物多选择己烯雌酚，也有选择苯甲酸雌二醇;根据各文献所使用的雌激素种类、剂量、作用时间、途径等的不同，雌激素的用量也不一致，文献多采用1～20 mg/kg腹腔或皮下注射给药［14］。我们根据制备痛经模型的周期，参考文献［12］中的方法，选择给予苯甲酸雌二醇，小鼠连续5 d腹腔注射10 mg/kg，大鼠连续3 d腹腔注射8 mg/kg的方法制备痛经模型，制备的模型效果较理想。

实验中对在体子宫收缩的评价有多种指标可以进行选择，可以用收缩频率、收缩幅度和平均收缩张力等多种指标进行描述，也有文献选取子宫活动力、延长子宫收缩时间［11］或基线提高［6］等。对于不同的药物以及同种药物不同剂量，这些指标的变化趋势可能有所不同。平均收缩张力是在单位时间子宫收缩曲线下面积，体现了一段时间内的平均值，能较全面反映子宫的收缩变化，故本实验采用平均收缩张力为指标进行统计。子宫是一个复杂的器官，存在多种调控子宫活性的途径，如前列腺素受体、缩宫素受体、血管加压素受体、H1受体、5-HT受体、M 受体、α、β受体及 Ca2+通道等［12］。实验中发现，痛经滴丸对给予缩宫素前的子宫收缩作用并不明显，这可能是由于痛经滴丸是与缩宫素受体相作用，在给予缩宫素后，由于受体与缩宫素结合的途径被阻断或拮抗，因此子宫收缩力受到抑制，而收缩的频率却不受到抑制。

本研究以痛经宝颗粒为对照药物，通过镇痛、抗炎试验、小鼠痛经模型等整体实验以及大鼠在体子宫试验评价痛经滴丸的主要药效，结果显示痛经滴丸能够减少醋酸所致痛经模型小鼠的扭体次数，对抗二甲苯所致耳肿胀炎症的作用，并有明显抑制缩宫素致小鼠痛经模型和大鼠在体子宫收缩的作用，这与中药当归、肉桂和延胡索的单味药效相一致，与对照药物痛经宝颗粒作用强度相当，为本药的开发应用于预防和治疗原发性痛经提供了初步药理学依据。

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