独角莲块茎的体外抗氧化活性及成分研究

宋 瑱， 李庆勇， 王春成， 高文轻， 姜春菲， 桑 梅

(东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150040)

独角莲Typhonium giganteum Engl.是天南星科Araceae犁头尖属Typhonium植物，中医用其块茎入药用于治疗中风痰壅、口眼歪斜、跌打损伤、毒蛇叮咬等症［1-2］。孙淑芬等报道其具有抗肿瘤活性［3］。近年来的研究显示癌症与体内过氧化反应有着密切关系，而至今都没有关于独角莲的抗氧化活性方面的报道。本实验通过两种抗氧化能力分析(DPPH和ABTS)来评价热回流提取、超声提取、负压空化提取3种不同工艺获得的独角莲块茎提取物的活性。有文献报道［4］黄酮和酚类都是具有酚羟基的还原性化合物，在复杂的反应体系中由于自身被氧化而具有清除自由基和抗氧化作用，为了确定独角莲醇提物中有效的抗氧化活性成分，本实验分别用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法和福林法对独角莲醇提物的总黄酮和总多酚进行测定，希望为进一步更深入和更充分的开发利用独角莲提供一定的依据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料 Unico2100紫外-可见分光光度计，KQ-250DB数控超声仪，DGX-9073 B-2鼓风干燥箱(上海福玛实验设备有限公司)，AB104电子天平，帕恩特超纯水机，ZLS系列真空离心浓缩仪(湖南赫西仪器装备有限公司)，RE-2000旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，Stat Fax-3200酶标仪(美国AWARENESS公司)。

独角莲于2010年10月购于吉林省独角莲种植开发基地，为四年生根茎，打成粉过20目筛。DPPH(1，1-diphenyl-2-pierylhydrazyl)试剂购自美国 Sigma公司;ABTS［2，2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)］抗氧化试剂盒内含 trolox(6-Hydroxy-2，5，7，8-tetram ethylchroman-2-carboxylic acid)购自碧云天生物技术研究所;芦丁(Rutin)标准品(98%);没食子酸标准品(98%，浙江省温州市瓯海化工试剂厂);水为超纯水;乙醇为分析纯。

1.2 独角莲块茎活性成分的提取 称取独角莲块茎粉末10 g共3份，分别采用热回流提取法、超声提取法、负压空化提取法提取活性成分。热回流提取法工艺参数:80%乙醇溶液，提取温度80℃，提取时间1 h，料液比1(g)∶10(mL)，共提取2次。超声提取法工艺参数:80%乙醇溶液，提取温度50℃，提取时间1 h，料液比1(g)∶10(mL)，共提取2次。负压空化提取法工艺参数:80%乙醇溶液，提取时间1 h，料液比1(g):10(mL)，共提取2次。上述提取液过滤后于60℃减压浓缩，所得浸膏真空干燥后放于－4℃冰箱中储存备用。

提取率(%)=提取所得浸膏的质量/提取所用原料的质量×100

1.3 抗氧化能力的测定

1.3.1 DPPH法测定抗氧化能力 将浸膏用80%乙醇溶解，分别配制成 0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL 的不同质量浓度样品，每2 mL样品溶液分别加入DPPH试剂2 mL(0.04 mg/mL)，避光放置反应30 min，以未加DPPH的80%乙醇为空白校正，以未加样品的DPPH溶液为空白对照，分别测517 nm处吸光度。吸光度的减少反映了抗DPPH自由基的活性。每组实验平行进行3次。

自由基清除率用以下公式计算得出:

DPPH 清除率(%)=(A对照－A样品)÷A对照×100%

A样品=不同浓度样品与DPPH反应后的吸光值

A对照=同体积的溶剂和DPPH试剂的吸光值

1.3.2 ABTS法测定抗氧化能力 独角莲80%乙醇提取物的总抗氧化能力采用碧云天ABTS总抗氧化能力测试试剂盒对其进行抗氧活性评价，实验方法按照试剂盒说明将ABTS溶液与氧化剂溶液等体积混匀后作为工作母液于室温避光保存12～16 h，使用前用80%乙醇稀释100倍，使吸光度在405 nm 波长处为0.7±0.02，得到ABTS+工作液。取稀释的ABTS+工作液0.2 mL置于96孔板中，分别加入不同浓度的 Trolox标准溶液(0.15 ～1.5 mmol/L)和 0.01 mL 各样品溶液(1.5 mg/mL)，混匀后室温下反应5 min，用酶标仪以405 nm为检测波长，450 nm为参比波长检测样品吸光度。以未加ABTS+工作液的80%乙醇为空白校正，以未加样品的ABTS+工作液为空白对照，每份样品平行操作3次。将Trolox标准溶液制成标准曲线 Y=0.1202X+0.1178，R2=0.9932，式中:X 为 Trolox浓度(mmol/L)，Y为吸光度。样品总抗氧化能力与Trolox标准溶液比较，确定其相对抗氧化能力(TEAC)。

1.4 抗氧化物质的测定

1.4.1 总黄酮的测定 精密称取芦丁10.0 mg，60%乙醇完全溶解后定容至100 mL作为标准溶液，精密吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL 芦丁标准溶液分别置于 10 mL具塞试管中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.30 mL，摇匀，6 min后再分别加入10%硝酸铝水溶液0.30 mL，摇匀放置6 min;然后分别加入4%氢氧化钠水溶液4.00 mL，用60%乙醇定容至刻度，摇匀，静置15 min后，以试剂为空白，在510 nm处测吸光度，由吸光度对质量浓度建立回归方程:Y=13.18X －0.0398，相关系数:R2=0.9983，式中:X 为黄酮质量浓度(mg/mL)，Y为吸光度。用60%乙醇将独角莲块茎提取物配制成5 mg/mL溶液，依照上述方法显色后在510 nm处测吸光值，依据芦丁标准曲线计算黄酮的质量浓度，并计算出各工艺提取物中黄酮成分的含有量。

1.4.2 总多酚的测定 精密称取没食子酸0.10 g用60%乙醇完全溶解后定容至100 mL，用移液枪分别移取0.00，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mL 定容至 10 mL，分别取出 1 mL溶液置于10 mL具塞试管中，再分别加入5 mL超纯水，1 mL福林试剂和7.5%Na2CO3溶液3 mL。充分混匀后在45℃下水浴1.5 h在765 nm处测吸光值。其线性方程为:Y=17.567X －0.0523;R2=0.9994，式中:X 为多酚质量浓度(mg/mL)，Y为吸光度。用60%乙醇将独角莲块茎提取物配制成1 mg/mL溶液依照上述方法显色后在765 nm处测吸光值，依据没食子酸标准曲线计算多酚的质量浓度，并计算出各工艺提取物中多酚成分的量。

2 结果与讨论

2.1 抗氧化能力分析

2.1.1 DPPH自由基清除能力 试验中不同工艺独角莲块茎提取物的自由基清除活性见图1。图1显示:独角莲块茎提取物对DPPH自由基有清除能力，并且在一定范围内呈质量浓度依赖关系，清除率随质量浓度增加而增强，当提取物质量浓度为0.8 mg/mL时，热回流和超声两种提取物对DPPH自由基的清除率均达到最大值，分别为90.34%和87.12%，而负压空化提取物的清除率为80.07%。热回流提取物、超声提取物、负压空化提取物对DPPH自由基的半清除率EC50见表1。

表1 独角莲块茎提取物对DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力(n=3)

2.1.2 清除ABTS自由基的能力 热回流提取物、超声提取物、负压空化提取物对ABTS自由基的总抗氧化能力与Trolox标准溶液比较所得的相对抗氧化能力见表1。

图1、表1显示，提取物的抗氧化能力强弱顺序为热回流提取物＞超声提取物＞负压空化提取物。

2.2 独角莲块茎提取物总黄酮和总多酚的测定 从表2中可以看出独角莲块茎成分的提取效率为热回流提取＞超声提取＞负压空化提取;总黄酮量由高到低为热回流提取物＞超声提取物＞负压空化提取物;总酚量由高到低为热回流提取物＞负压空化提取物＞超声提取物。热回流、超声和负压空化这3种提取物中，总黄酮和总多酚的总量分别约为34.82%、29.73%和31.14%。其中负压空化提取对独角莲块茎成分的提取率(6.46%)虽然很低，但是提取物中总黄酮和总酚的量还是很高的，约占总提取物的31.14%。

表2 不同工艺下独角莲块茎提取物中总黄酮和总多酚的量

3 结论

医学研究表明自由基及其代谢产物能够诱发多种疾病，例如糖尿病、白内障、炎症、动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症等。已有研究发现传统的化学合成抗氧化剂具有一定的副作用和致癌性等缺点，不宜长期使用［7］。而许多天然抗氧化剂能够促进体内抗氧化酶与内源性抗氧化剂的合成，有效清除体内过多自由基，因此越来越多的学者关注天然抗氧化剂的研究［5-8］。独角莲作为一种传统的中药在免疫调节、抗炎、抗肿瘤等方面有广泛的药理作用［9］，但迄今为止，有关其抗氧化活性方面的研究还未见报道。

本实验通过使用DPPH试剂和ABTS总抗氧化能力试剂盒分别对3种不同工艺的独角莲块茎提取物进行了抗氧化能力的测试，图1和表1都可以看出3种独角莲块茎提取物对DPPH自由基和ABTS自由基均具有清除活性，清除能力强弱顺序均为热回流提取物＞超声提取物＞负压空化提取物。

表2显示:3种不同工艺的独角莲块茎提取物的总黄酮和总多酚测定中，热回流提取物的总黄酮和总酚量明显高于超声提取物和负压空化提取物，这也印证了3种提取物中热回流提取物的抗氧化活性最好的结论。超声提取物的总黄酮量略高于负压空化提取物的总黄酮量，而负压空化提取物的总酚量微高于超声提取物，结果与两种提取方法的提取物的抗氧化能力相似。

3种不同提取方法中热回流提取效率最高，并且热回流提取物的抗氧化活性最好，提取物中总黄酮和总多酚的含有量也是最高的，这一系列的实验结果可为今后独角莲抗氧化活性成分总黄酮及总酚的高效提取提供依据。

3种不同工艺的提取物的抗氧化能力不同，其原因可能是由于不同提取物中抗氧化成分组成和含有量不同，而且其中各物质的协同作用可能不一致，导致了不同方法提取的独角莲块茎提取物的抗氧化能力不同。其机理还有待进一步深入研究，这也是今后研究的目标。

本研究为利用独角莲块茎开发天然抗氧化功效因子提供了依据，但由于是在体外进行研究，而生物体内的氧化代谢是很复杂的，因此，还有待于从生物体内源抗氧化酶系活性和生物大分子氧化代谢产物水平的角度来进一步研究独角莲块茎的抗氧化作用机制。

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［3］孙淑芬，曾 艳，赵维诚.独角莲抑制恶性肿瘤的实验研究［J］.中医研究，1998，11(6):8-10.

［4］赵继红，梁 宇，颜达予.黄酮类化合物抗氧化活性的结构因素［J］.北方工业大学学报，2001，13(1):36-43.

［5］樊梓鸾，王振宇.红豆越橘体外抗氧化和抗细胞增殖活性研究［J］.现代食品科技，2010，26(10):1081-1086.

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