大鼠口服苏合香丸10天后对肝肾功能的影响及汞蓄积情况

李海芳， 孙 鹏， 迪丽努尔·沙比托夫， 杨玲玲， 闫明俞， 刘君康

(新疆维吾尔自治区食品药品检验所，新疆乌鲁木齐830004)

苏合香丸是著名的温通开窍药，被《中国药典》收录，现代临床多用于中风所致的神志不清、牙关紧闭、半身不遂重症，至今仍是抢救煤气中毒和心肌梗塞、心绞痛的有效药物。该药处方中含有朱砂矿物药材，由于历史原因，该药基础研究薄弱，随着中药安全性问题日益引起重视，朱砂的毒性问题也引起了国内外广泛的关注［1-2］。因此，本实验进行了大鼠口服苏合香丸10 d后对其肝肾功能的影响及汞蓄积情况的研究。

1 实验材料

1.1 实验动物 wistar大鼠，(150±30)g，雄性，清洁级。购于新疆医科大学实验动物中心，动物许可证号SCXK(新)2003-0001。

1.2 试药 苏合香丸(批号:JB65001、8010079、9010464、9010171)大蜜丸3 g/丸;朱砂细粉(本所药材标本室提供)。

制备方法:取一丸苏合香丸剪碎后，用5%羧甲基纤维素钠溶液30 mL溶解，使用拍打式无菌均质器拍打180 s，制备成0.1 g/mL的混悬液;精密称取朱砂细粉105 mg，加入5%羧甲基纤维素钠溶液30 mL，制备成3.5 mg/mL的混悬液。每天临用现配。

1.3 试剂 硝酸(优级纯，批号20100508，北京化工厂);硫酸(优级纯，批号20100508，北京化工厂);盐酸(优级纯，批号100325，西安化学试剂厂);硼氢化钾(优级纯，批号20100617，天津市光复精细化工研究所);氢氧化钾(分析纯，批号20070720，天津市福晨化学试剂厂);重铬酸钾(分析纯，批号20030407，天津市化学试剂三厂)。

1.4 标准品 汞单元素标准溶液(GBW 086178094，标准值1000 μg/mL，中国计量科学研究院);鱼肉中的总汞与甲基汞含量标准物质［GBW 100290801，总汞标准值(0.85±0.03)mg/kg，甲基汞标准值(0.84 ±0.03)mg/kg，中国计量科学研究院］。

1.5 仪器 组织匀浆机(D-130，WIGGEN HAUSER);低温冰箱(型号MDF-U333，三洋医用生物电子有限公司);低温高速离心机(SIGMA3K15型，德国SIGMA公司);电子天平(BP221S，北京赛多利斯天平有限公司);拍打式无菌均质器(BD-400，南京贝帝实验仪器有限公司);双道原子荧光光度计(AFS-830a，北京吉天仪器有限公司)。智能电热消解仪(型号LabTach，莱伯泰科公司)。

2 实验方法和检测指标

2.1 试验分组 wistar大鼠，60只，随机分为6组，即阴性组、苏合香丸Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、朱砂组。阴性组灌胃给予等容量的5%羧甲基纤维素钠溶液;苏合香丸Ⅰ组(批号8010079)、Ⅱ组(批号9010464)、Ⅲ组(批号 9010171)、Ⅳ组(批号JB65001)、朱砂组分别灌胃给予相应组的供试液0.5 mL/100 g。每天一次，连续灌胃10 d。

2.2 检测指标

2.2.1 肝肾功能相关血生化指标检验 最后一次给药后，所有大鼠禁食不禁水18 h，称量体质量后，25%乌拉坦溶液(0.4 mL/100 g)腹腔注射进行麻醉，腹主动脉取血离心制备血清进行谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血清胱抑素、尿素氮、肌酐的检验。同时小心剥取大鼠肝脏及肾脏并称质量，计算脏器系数。

2.2.2 组织病理学检查 右肾及剩余肝脏组织浸泡于10%甲醛溶液中备用进行组织病理学检查。

2.2.3 肝肾组织中总汞的测定 取所有大鼠的左肾及部分肝脏组织使用双道原子荧光光度计检测动物组织中总汞量。

3 统计方法 采用SPSS 11.0 统计软件进行统计分析。

4 结果

4.1 大鼠口服苏合香丸10 d后对体质量的影响 大鼠口服苏合香丸、朱砂粉10 d后的体质量增长正常，毛发光泽，经统计检验各组较阴性对照组比较无显著性差异。见表1。

表1 大鼠口服苏合香丸10 d后对体质量的影响(± s，n=10)

表1 大鼠口服苏合香丸10 d后对体质量的影响(± s，n=10)

/g阴性组组别 初给药体质量/g 10 d后体质量146.1 ±27.5 181.4 ±23.0苏合香丸Ⅰ组 146.2 ±26.8 177.7 ±23.0苏合香丸Ⅱ组 158.6 ±30.8 180.1 ±30.4苏合香丸Ⅲ组 160.6 ±37.3 191.7 ±38.3苏合香丸Ⅳ组 151.8 ±34.9 183.1 ±31.0朱砂组147.6 ±30.4 179.9 ±27.4

4.2 大鼠口服苏合香丸10 d后对肝、肾脏器系数的影响大鼠口服苏合香丸、朱砂粉10 d后，解剖大鼠对心、肝、脾、肺、肾等主要脏器进行肉眼观察，结果发现各组均无明显病变情况。称量肝、肾组织的湿质量，按体质量折算脏器系数(脏器质量g/100 g体质量)，经统计检验各组大鼠脏器系数较阴性对照组比较无显著性差异。见表2。

4.3 大鼠口服苏合香丸10 d后对血液生化指标的影响大鼠口服苏合香丸、朱砂粉10d后，用25%乌拉坦溶液(0.4 mL/100 g)腹腔注射进行麻醉，腹主动脉取血进行肝功能及肾功能相关血生化指标检验［3］。结果表明:朱砂组与阴性组比较肝功能及肾功能均有损伤迹象，即谷草转氨酶、血清胱抑素、肌酐数值显著性增高(P＜0.05);尿素氮数值与阴性组比较有显著性降低(P＜0.05)。苏合香丸各组肌酐数值与阴性组比较均有显著性增高(P＜0.05，P＜0.01)，表明苏和香丸在本实验条件下对肾功能有一定影响。见表3。

表2 大鼠口服苏合香丸10 d后对大鼠肝肾脏器系数的影响(± s，n=10)

表2 大鼠口服苏合香丸10 d后对大鼠肝肾脏器系数的影响(± s，n=10)

组别 肝脏g/(100 g体质量)肾脏g/(100 g体质量)2.74 ±0.23 0.63 ±0.05苏合香丸Ⅰ组 2.77 ±0.25 0.63 ±0.05苏合香丸Ⅱ组 2.75 ±0.26 0.65 ±0.07苏合香丸Ⅲ组 2.68 ±0.17 0.61 ±0.06苏合香丸Ⅳ组 2.65 ±0.13 0.63 ±0.04朱砂组阴性组2.60 ±0.17 0.61 ±0.05

表3 大鼠口服苏合香丸10 d后对大鼠血液生化指标的影响(± s，n=10)

表3 大鼠口服苏合香丸10 d后对大鼠血液生化指标的影响(± s，n=10)

注:各组与阴性组比较:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001。

组别 谷丙转氨酶ALT/(U·L－1)谷草转氨酶AST/(U·L－1)ALT/AST 血清胱抑素/(μg·mL－1)尿素氮BUN/(mmol·L －1)肌酐Cr/(μmol·L －1)BUN/Cr阴性组 76.90 ±39.83 229.40 ±99.93 3.06 ±0.94 1.08 ±0.22 11.09 ±0.86 36.10 ±6.37 0.31 ±0.05苏合香丸Ⅰ组 75.40 ±13.75 243.30 ±57.97 3.27 ±0.66 1.59 ±0.45 10.94 ±1.24 47.50 ±8.46* 0.24 ±0.04＊＊＊苏合香丸Ⅱ组 72.70 ±17.99 215.80 ±43.66 3.02 ±0.45 1.39 ±0.32 11.29 ±0.90 44.50 ±4.03＊＊ 0.26 ±0.03＊＊苏合香丸Ⅲ组 64.70 ±25.11 223.90 ±63.51 3.62 ±0.83 1.46 ±0.35 10.89 ±1.22 43.90 ±6.90＊＊ 0.25 ±0.04＊＊苏合香丸Ⅳ组 87.30 ±27.94 270.30 ±52.64 3.22 ±0.49 1.34 ±0.16 11.15 ±0.64 44.30 ±4.27＊＊ 0.26 ±0.03＊＊朱砂组 118.10 ±45.16 298.90 ±92.29*2.64 ±0.40 1.49 ±0.19* 10.19 ±0.92* 42.90 ±4.68* 0.24 ±0.04＊＊＊

4.4 大鼠口服苏合香丸10 d后对肝肾组织病理学的影响大鼠解剖肉眼观察各组大鼠肝、肾均未见明显异常。毒性病理组织形态检查结果显示苏合香丸各组、朱砂组与阴性对照组相比较均未见到有关的病理改变，在本次实验条件下，各组均未对大鼠肝、肾造成病理性损伤。

4.5 大鼠口服苏合香丸10 d后肝肾组织中总汞的测定［4］

4.5.1 样品的处理方法［5］精密称取大鼠肝脏和肾脏组织各0.5 g，分别置50 mL聚丙烯消解管中，加入硝酸∶硫酸(V/V，3∶1)4 mL，于智能电热消解仪中120℃恒温消解3 h，放冷，加双氧水0.5 mL，摇匀，消解 0.5 h，取出冷却至室温，用5%盐酸加至聚丙烯消解管10 mL刻度处，摇匀。取1.0 mL，转移至刻度管中加5%盐酸定容至10 mL，摇匀后进行测定，同时做试剂空白。

4.5.2 大鼠肝肾组织中总汞测定方法学研究

4.5.2.1 仪器条件［6］光电倍增管负高压270 V;灯电流(峰值)26 A;原子化器高度8 mm;载流液5%盐酸溶液;还原剂为20 g/L KBH4+5 g/L KOH;载气(Ar)流量300 mL/min;测量方式为标准曲线法。

4.5.2.2 标准曲线测定 吸取汞标准溶液1000 μg/mL，5.0 mL于100 mL 量瓶中，用5%HNO3(含 0.5 g/L K2Cr2O7，保护Hg2+不还原成单质汞而被玻皿吸附)溶液定容至刻度，摇匀。用5%盐酸溶液稀释至汞溶液质量浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/L。按上述测定条件设置仪器参数，稳定30 min后开始测定，记录荧光强度，以质量浓度(μg/L)为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。汞浓度在0～2.0 μg/L范围内，含量与荧光强度呈正相关，γ为0.9995。

4.5.2.3 标准物质鱼肉(GBW 100290801)中的总汞回收率测定 称取标准物质鱼肉9份，每份约0.2 g，精密称定后，置50 mL聚丙烯消解管中，加入硝酸∶硫酸(V/V，3∶1)4 mL，于智能电热消解仪中120℃恒温消解3 h，放冷，加双氧水0.5 mL，摇匀，消解0.5 h，取出冷却至室温，用纯水加至聚丙烯消解管10 mL刻度处，摇匀。取1.0 mL，转移至刻度管中加5%盐酸定容至10 mL，摇匀后进行测定，同时做试剂空白，测定结果均在标准值范围内，回收率达到要求，为0.82～0.88 mg/kg。

4.5.2.4 正常大鼠肝脏组织加标回收率测定 正常大鼠肝脏组织匀浆后称取12份，每份约0.5 g，精密称定后，置50 mL聚丙烯消解管中。1～3份用于测定肝脏组织中汞的浓度;4～6份(加标 A-1～3)加入0.5 μg/mL 汞标准溶液 0.04 mL;7～9份(加标 B-1～3)加入0.5 μg/mL 汞标准溶液 0.1 mL;10～12份(加标 C-1 ～3)加入 0.5 μg/mL 汞标准溶液0.16 mL，每份加入硝酸∶硫酸(V/V，3 ∶1)4 mL，按照前述样品处理方法进行消解，消解液稀释后进行测定，同时做试剂空白，测定结果各组回收率为107% ～122%。详见表4。

表4 正常大鼠肝脏组织中汞加标回收实验结果

4.5.2.5 精密度及检出限 仪器检测精密度为3.92%。仪器检出限为0.0045 μg/L(相关系数0.9940，n=5)。方法检出限为0.01355 μg/L。

4.5.3 计算 肝、肾组织中含汞量，代入下列公式计算:X=(C1－C0)×V/m。式中X:样品中汞的质量分数(μg/g);C1:测定样液中汞的含有量(μg/L);C0:试剂空白中汞的含有量(μg/L);v:为样品消解定容后总体积;m为样品称样量(g)。

4.5.4 大鼠口服苏合香丸10 d后肝、肾组织中汞测定 将消解好的样品稀释后进行检测，检测结果表明:大鼠口服苏合香丸10 d后与阴性组比较，在肝脏和肾脏均有明显的蓄积，且在肾脏的蓄积更为显著。具体见表5。

表5 大鼠口服苏合香丸10 d后肝、肾组织中含汞量(± s，n=10)

表5 大鼠口服苏合香丸10 d后肝、肾组织中含汞量(± s，n=10)

注:各组与阴性组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001。

组别 肝脏中汞/(μg·g－1) 肾脏中汞/(μg·g－1)阴性组0.0944 ±0.0343 0.0644 ±0.0267苏合香丸Ⅰ组 0.1049 ±0.0224 0.2335 ±0.0444＊＊＊苏合香丸Ⅱ组 0.1419±0.0319＊＊＊ 0.3099±0.1166＊＊＊苏合香丸Ⅲ组 0.1382 ±0.0357* 0.3018 ±0.1290＊＊＊苏合香丸Ⅳ组 0.1342 ±0.0286* 0.3148 ±0.0656＊＊＊朱砂组 0.1756 ±0.0328＊＊＊ 0.3876 ±0.1090＊＊＊

4.5.5 大鼠口服苏合香丸10 d后肝、肾中总汞蓄积率测定经前期测定［7］，得知实验各批号苏合香丸中成药的总汞量，计算每克组织中的汞蓄积率，发现汞在肾脏组织蓄积高于在肝脏组织的蓄积。计算公式:每克组织中汞蓄积率(‰)=每克组织中汞量×1000/(大鼠日服用量×苏合香丸总汞量×10)。具体结果见表6。

表6 大鼠口服苏合香丸10 d后肝、肾中总汞蓄积率测定结果

5 讨论

汞的毒性已众所周知，以硫化汞为主要成分的朱砂的毒性也已引起人们的高度警惕和重视。但目前仍有大量的中药成方制剂含有朱砂［8］，这些制剂多以经典方为主，由于历史原因，这些制剂的基础研究非常薄弱。由于我国开展重金属限量标准的研究工作较晚，目前仅对部分中药产品中的Pb、Hg、As等量作了限制，对大多数中药(包括中药生药、制剂、提取物)目前尚未制定和完善其限量标准［9］。我国对《中国药典》中的朱砂剂量进行过修订，如1990年版及以往的历版药典朱砂日用剂量较大，为0.3～1.5 g，1995年版将朱砂剂量降至0.1～0.5 g，至2010年版仍为该限定剂量。2005年版《中国药典》收录的含朱砂的成方制剂达46个，占《中国药典》收载制剂的8.1%;2010年版《中国药典》收录的含朱砂的成方制剂达54个，占《中国药典》收载制剂的5.1%。鉴于含有朱砂的成方制剂在《中国药典》占有相当的数量，所涉及的制剂及其功能主治、临床适应症数量、种类繁多，重新评价朱砂在成方制剂中的毒性和应用价值的工作就凸显出了迫切性。

苏合香丸是含有朱砂的成方制剂，目前被《中国药典》收录。我们对其进行了大鼠口服10 d的毒性评价工作。发现大鼠口服苏合香丸后对其体质量、肝肾器官脏器系数没有影响;血生化检验中未发现其对肝功能敏感指标谷丙转氨酶和谷草转氨酶有影响，对肾功能敏感指标血清胱抑素、尿素氮、肌酐检验后发现服药组肌酐数值与阴性组比较均有显著性增高(P＜0.05)，但数值仍在正常值范围内;病理组织形态学检查显示该药品在10 d饲喂后未造成大鼠肝肾组织病理性损伤;经双道原子荧光光度计测定组织中的总汞，发现在肝肾组织中有汞蓄积现象，且在肾脏的蓄积率远远高于肝脏。

在本实验中选择的大鼠灌胃剂量为临床人用最大剂量，在该剂量下服用10 d即可显示出肌酐数值出现增高趋势。如果超剂量服用或超时服用，依据本次实验结果提示可能会引起肌酐数值的进一步增高，可能会超过正常值范围甚至产生病理性损伤。

汞的灵敏度非常高，因此需要特别注意来自各方面的污染［10-11］。实验中用到的所有器皿必须经过20%HNO3(V∶V)浸泡过夜，并用去离子水清洗干净后方能使用。通常分析纯试剂中可能会含有少量汞，影响实验测定结果，尤其是盐酸，故所有试剂应尽可能采用优级纯，同时要作试剂空白用来扣除试剂带来的影响。

另外，考虑到大鼠性别差异对血生化数值的影响［12］，本次研究仅选择同一性别的大鼠进行了实验。

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