车前草总三萜对四氯化碳致小鼠肝损伤的保护作用

杨亚军， 李庆耀， 梁生林， 孙朝越， 刘 兵， 张 杰， 王 磊， 崔 燎

(1.井冈山大学医学院，江西吉安343000;2.南方医科大学中医药学院，广东广州510515;3.井冈山大学医学院附属医院，江西吉安343000;4.广东医学院药理学教研室，广东湛江523808)

车前草为车前科(Plantaginaceae)植物车前Plantago asiatica L.或平车前Plantago depressa Willd.的干燥全草，是《中国药典》(2010年版)收载的常用中药。车前草性寒，味甘，具有清热解毒、利尿、祛痰、凉血之功效，用于水肿尿少、暑湿泻痢、痰热咳嗽、痈肿疮毒等症［1］。据报道，车前草全草或其复方，在临床上可用于治疗慢性肝炎［2-3］，车前草粗提物对CC14致急性肝损伤有保护作用［4-5］。研究表明，车前草中含有熊果酸、齐墩果酸等三萜类化合物［6］，二者均为抗肝炎活性物质［7］，且后者已制成抗肝炎药在临床上广泛应用。因此，本研究以自制车前草总三萜(TTP)为实验材料，采用CC14诱导小鼠急性肝损伤模型，观察TTP对急性肝损伤的保护作用，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物和试剂 江西产车前草，购自亳州市远光中药饮片厂，批号20090901，经井冈山大学医学院药学教研室彭才圣教授鉴定为平车前Plantago depressa Willd.;TTP浸膏，自制，经测定其总三萜含有量可达53%;水飞蓟宾胶囊，购自天津天士力制药股份有限公司生产，批号100604;CCl4，分析纯，南京化学试剂厂生产;丙氨酸氨基转移酶(ALT，批号2010102)、天冬氨酸氨基转移酶(AST，批号2010104)、总超氧化物歧化酶(T-SOD，批号2010101)、丙二醛(MDA，批号2010104)与总蛋白(T-Protein，批号2010103)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 动物 昆明种小鼠，雌雄各半，体质量为20～24 g，由江西中医学院实验动物中心提供，清洁级，实验动物生产许可证号SCXK(赣)2005-0001，实验动物使用许可证号JZDWNO.2010-0287。

1.3 仪器 FA1604N电子天平;spectrumlab 53紫外-可见分光光度计;电热恒温水浴锅;低温高速离心机;数显恒温水浴锅HH-4。

2 方法

2.1 动物分组和造模方法 小鼠随机分为5组，分别为正常对照组、模型组、阳性药水飞蓟宾组、TTP高剂量组和TTP低剂量组，每组10只。各组试药均用0.5%羧甲基纤维素钠配成混悬液，自造模前7 d起，每天按0.1 mL/10 g体积灌胃给药1次，共7次，正常对照组给予等体积溶剂。末次给药2 h后，小鼠腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液0.2 mL/kg，正常对照组腹腔注射等体积花生油，在造模期间禁食，可自由饮水。实验期间，所有小鼠均食用标准条状饲料，并观察记录其精神状态、反应活动、毛发光泽、食欲排泄、体质量变化等情况。造模18 h，小鼠称质量后，于眼眶后静脉丛采血，室温放置30 min后，3500 r/min离心15 min，取上清液备用;小鼠处死后，取其肝脏，预冷生理盐水冲洗，拭干，称质量，取肝脏右叶同一部位经10%甲醛固定，用于病理学切片观察;称取定量组织，用冷生理盐水制成10%的肝匀浆，于4℃3000 r/min离心15 min，取上清液备用。

2.2 生化指标测定方法 血清中AST和ALT的含有量，肝组织中T-Protein、T-SOD、MDA的量，均按照试剂盒说明书规范操作。

2.3 组织切片观察 组织10%甲醛溶液固定24 h后，石蜡包埋后制成5 μm切片，HE染色，光镜下观察肝组织病理学变化。将肝组织损伤程度分为4级［8］:0级(-)，肝组织结构正常，无明显变性，坏死及炎症细胞浸润;l级(+)，肝小叶结构尚正常，可见明显的混浊肿胀，散在的脂肪变性和细胞点状坏死，偶见炎症细胞浸润;2级(++)，肝小叶结构不清，可见局部区域性脂肪变性和细胞灶状坏死，伴有较多炎症细胞浸润;3级(+++)，肝小叶结构不清、可见弥漫性变性、坏死，伴有明显区域性炎症细胞浸润。

3 结果

3.1 一般情况 各组小鼠在造模前生长状态良好，进食饮水正常，毛色光滑润泽，粪便呈褐色颗粒状;造模后，除正常对照组外，其余各组小鼠均不同程度表现为少动聚集，反应迟缓，容易激怒，难以捉拿，毛发蓬乱，毛色暗淡，大便稀软，但各组均没有出现死亡情况。

各组小鼠灌胃后未见明显中毒症状，实验前后各组小鼠体质量与正常对照组相比均无显著性差异(P＞0.05)。小鼠腹腔注射CCl4后，肝脏系数值比正常对照组增大，但模型组与空白对照组相比具有显著性差异(P＜0.01)。除阳性药外，TTP高、低剂量组小鼠肝脏系数均较模型组小鼠显著降低(P＜0.05)。结果见表1。肝脏系数为小鼠肝脏湿质量占处死前体质量的百分比。

3.2 TTP对致肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响 与正常对照组相比，造模后各组小鼠血清ALT和AST的活性均显著性升高(P＜0.01)，说明急性肝损伤模型复制成功;与模型组相比，TTP能降低模型小鼠ALT与AST水平，且低剂量TTP对AST的影响具有显著性差异(P＜0.01)，见表2。

3.3 TTP对致肝损伤小鼠血清T-SOD和MDA的影响 造模后，小鼠肝组织中蛋白量普遍增高，但是给药小鼠蛋白量均下降，且与模型组小鼠蛋白量有显著性差异。同时，模型组小鼠肝组织中T-SOD水平下降，脂质过氧化产物MDA量升高，TTP和水飞蓟宾均能增强T-SOD活性，降低MDA量(P ＜0.01)，见表3。

表1 实验前后各组小鼠体质量变化与肝脏系数(± s，n=10)

表1 实验前后各组小鼠体质量变化与肝脏系数(± s，n=10)

注:与正常对照组相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组相比，#P ＜0.05。

/%正常对照组组别 剂量/(g·kg-1)初始体质量/g终末体质量/g肝脏系数- 23.7 ±0.8 27.3 ±2.0 4.84 ±0.26模型组 - 23.0 ±1.4 26.5 ±1.7 5.21 ±0.12＊＊阳性药组 0.15 22.7 ±1.2 25.6 ±1.9 5.34 ±0.45*TTP 高剂量组 0.04 21.8 ±2.1 25.3 ±1.8 4.95 ±0.29#TTP 低剂量组 0.02 22.4 ±2.0 26.8 ±2.3 4.99 ±0.20#

表2 TTP对CCl4致肝损伤小鼠血清中AST和ALT的影响(± s，n=10)

表2 TTP对CCl4致肝损伤小鼠血清中AST和ALT的影响(± s，n=10)

注:与正常对照组相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

组别 剂量/(g·kg-1)ALT/(IU·L-1) AST/(IU·L-1)正常对照组- 21.50 ±8.91 49.15 ±6.41模型组 - 154.75 ±12.74＊＊ 198.26 ±27.10＊＊阳性药组 0.15 107.76 ±19.51＊＊#174.82 ±25.18＊＊#TTP 高剂量组 0.04 128.55 ±10.45＊＊ 168.05 ±32.49＊＊#TTP 低剂量组 0.02 110.20 ±16.56＊＊#156.35 ±28.70＊＊#

表3 TTP对CCl4致肝损伤小鼠组织中T-SOD和MDA的影响(± s，n=10)

表3 TTP对CCl4致肝损伤小鼠组织中T-SOD和MDA的影响(± s，n=10)

注:与正常对照组相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

组别 剂量(g·kg-1) T-Protein/(g·L-1) T-SOD/(U·mgpro-1) MDA/(nmol·mgpro-1)正常对照组0.98 ±0.31 166.03 ±33.22 4.89 ±1.72模型组 - 1.11±0.06 96.62±17.72＊＊ 6.69±1.80*阳性药组 0.15 1.03 ±0.05# 131.78 ±20.37*# 4.20 ±1.83#TTP 高剂量组 0.04 1.00 ±0.10# 142.98 ±26.81# 4.04 ±1.59#TTP 低剂量组 0.02 1.10 ±0.06# 153.26 ±42.37# 4.30 ±1.56-#

3.4 TTP对急性肝损伤小鼠肝脏病理形态学的影响

3.4.1 肉眼观察 正常对照组小鼠肝脏组织呈鲜红色，外表光滑亮泽，质地柔软，富有弹性;模型组小鼠肝脏组织呈暗红色，表面粗糙，附着肉眼可见的黄色颗粒，缺乏弹性，体积肿大，而给药各组小鼠肝脏病变较模型为轻。

3.4.2 光镜观察 正常对照组小鼠基本无异常;模型组小鼠肝小叶中央区明显灶状坏死，细胞不圆整，结构不清晰，细胞核较小，出现水肿和气球样变，有大量脂肪变性，细胞间质有炎性细胞浸润;给药组和阳性药组中肝组织炎性细胞浸润减轻，肝细胞变性、坏死等病理性损伤均有不同程度的缓解，其中，TTP低剂量组最为明显，见表4。

表4 TTP对CCl4致肝损伤小鼠肝组织病理损伤的影响(± s，n=10)

表4 TTP对CCl4致肝损伤小鼠肝组织病理损伤的影响(± s，n=10)

注:与正常对照组相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

组别 剂量/(g·kg-1)肝细胞变性P 肝细胞坏死P 炎性浸润P- + ++ +++- + ++ +++- + ++ +++- 10 0 0 0 10 0 0 0 9 1 0 0模型组 - 0 2 6 2 ＊＊ 0 2 5 3 ＊＊ 0 0 4 6 ＊＊阳性药组 0.15 3 5 1 1 ＊＊# 3 4 2 1 ＊＊# 3 5 2 0 ＊＊#TTP高剂量组 0.04 2 4 3 1 ＊＊ 2 6 1 1 ＊＊ 3 6 1 1 ＊＊#TTP低剂量组 0.02 3 4 3 0 ＊＊# 4 4 2 0 ＊＊# 2 8 0 0 ＊＊#正常对照组

4 讨论

CCl4是研究实验性肝损伤模型常用的化学诱导剂，可造成模型动物脂质过氧化产物MDA大量生成，氧自由基清除剂SOD水平明显下降，造成的肝炎模型在形态学与病理学方面与人类肝损伤极为相似，因此，该模型已成为筛选和研究治疗肝炎类药物的经典模型［10］。TTP可降低MDA量，提高肝组织中T-SOD活性，提示TTP可提高CCl4致急性肝损伤后小鼠的抗氧化能力，减轻肝细胞的变性坏死和炎性浸润等病理变化，并能够降低肝脏系数。至于TTP对肝损伤的保护作用是否还存在其它机制，尚须进一步深入研究。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:64.

［2］陈剑屏，袁启霞.车前草汤治疗慢性活动肝炎232例［J］.上海中医药杂志，2002(11):18-19.

［3］王庆学，王朝晖.车前全草糖浆治疗慢性迁延性肝炎［J］.中华腹部疾病杂志，2005(10):761.

［4］俞亚静，方晶.车前草水提取物对肝脏保护作用的实验研究［J］.中国实用医药，2008，3(16):71-72.

［5］Türel I I，Özbek H，Erten R，et al.Hepatoprotective and anti-inflammatory activities of Plantago major L［J］.Indian J Pharmacol，2009，41(3):120-124.

［6］邹盛勤.车前草中乌索酸和齐墩果酸含量的反相高效液相色谱法测定［J］.时珍国医国药，2006，17(11):2119-2120.

［7］熊筱娟，陈 武，肖小华，等.乌苏酸与齐墩果酸对小鼠实验性肝损伤保护作用的比较［J］.江西师范大学学报:自然科学版，2004，28(6):540-543.

［8］潘定举.用Excel 97编制等级资料的Ridit分析表格［J］.中国卫生统计，2000，17(3):179-180.

［9］魏 来，赵春景.番茄素对急性肝损伤模型大鼠的保护作用［J］.中国药房，2007，18(4):258-260.

［10］龚峻梅，朴英杰，陈素云，等.急性CCl4肝损伤的研究进展［J］.国外医学·生理、病理科学与临床分册，2002，22(3):308-310.