胃腺癌中CDX2、VEGF、CD44、EGFR和pRb的表达及预后意义

徐 晓 欧阳斌燊 欧阳卫泽

(九江学院附属医院 江西九江 332000)

目前胃癌治疗方案的采用取决于TNM分期体系。TNM分期取决于肿瘤浸润的深度，淋巴结受累的数目和是否有远处转移。处于相同分期的不同病人，预后表现不同。因此，有必要寻求一些与预后相关的生物标记物和新的靶向治疗位点。目前认为不同的肿瘤恶性表型与其诸多基因改变和多种生物标志物的表达差异密切相关。因此，联合检测生物标记物的方法有望能够更为准确地评估胃腺癌患者的预后。

1 材料和方法

1.1 病例选择

收集2002年2月～2003年10月间江西省人民医院和九江学院附属医院胃腺癌手术切除标本140例，随访到生存资料可作回顾性分析的有68例，随访时间1～60个月。140例胃腺癌术前均未经放疗和化疗，术前或术后均经病理证实并重新评估为胃腺癌。标本均经10%的福尔马林固定、常规石蜡包埋和苏木精－伊红 (HE)染色。胃腺癌组织学类型和分化程度按照2002年世界卫生组织 (WHO)提出的标准［1］;年龄、性别、肿瘤大小 (测量肿瘤最大直径)、Laurén＇s分类、浸润深度、淋巴结和远处转移依据文献所述［1－2］;切缘累及是镜下切缘可见胃腺癌细胞浸润;TNM分期依据美国癌症联合委员会 (AJCC)提出的标准［3］。

1.2 免疫组织化学染色

采用EnVision二步法，高温高压热修复抗原，二氨基联苯胺 (DAB)显色。CDX2、VEGF、CD44、EGFR、pRb及所用二抗和DAB均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，采用PBS代替一抗作为空白对照。

1.3 染色结果判定［4］

染色结果判定采用半定量方法，通过评估染色强度和细胞阳性率来评分。目标细胞:胃腺癌组织中的癌细胞。阳性信号:CDX2、pRb染色定位于细胞核，EGFR、CD44染色定位于细胞膜，VEGF染色定位于细胞质。染色强度评分:无着色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。细胞阳性率计算随机抽取5个高倍 (40×10)视野，计数每个高倍视野全部胃癌细胞及其着色的阳性细胞，然后计算阳性细胞的百分数。细胞阳性率分为0、＜5%、5～50%、＞50%，分别评0分、1分、2分、3分。染色结果根据染色强度和细胞阳性率分数相加所得积分，分成0和2分阴性(－)、3～4分阳性 (+)和5～6分强阳性 (++)3个等级。其中阴性组积分0和2分，阳性组积分3～6分。

1.4 统计分析

统计分析采用SPSS13.0进行处理，以p＜0.05有统计学意义，p＜0.01有显著统计学意义。临床病理特征和免疫组化数据分析采用χ2检验分析。生存分析单因素分析用Kaplan－Meier法和Log－Rank检验计算并比较肿瘤相关蛋白和临床病理特征与68例胃腺癌患者术后生存期之间的关系;多因素分析用COX比例风险回归模型和逐步前进法分析肿瘤相关蛋白、临床病理特征与患者术后生存期的关系。

2 结果

2.1 胃腺癌中CDX2、VEGF、CD44、EGFR、pRb的表达及与临床病理特点的关系

140例胃腺癌手术标本中，CDX2阳性40例(28.6%)，EGFR阳性45例 (32.1%)，pRb阳性44例 (31.4%)，VEGF阳性62例 (44.3%)，CD44阳性53例 (37.9%)，5种蛋白的阳性表达如图1－5。CDX2的表达与 Laurén＇s分型有关，其阳性表达率在肠型胃癌中明显高于弥漫型胃癌(χ2=5.657，p=0.017);VEGF的表达与年龄、Laurén＇s分型有关，在年龄≥50岁的病例中表达率高于年龄 ＜50岁组 (χ2=5.422，p=0.020);在肠型胃癌的表达率明显高于弥漫型胃癌 (χ2=4.421，p=0.035);CD44的表达与切缘累及有关，在切缘累及的胃癌组表达率明显高于无切缘累及组 (χ2=4.729，p=0.042);EGFR的表达与TNM分期相关，在I/II期的阳性表达率明显高于III/IV期 (χ2=3.889，p=0.049);pRb的阳性表达率在男性胃癌组明显高于女性组 (χ2=6.609，p=0.010)(见表1)。

2.2 CDX2、VEGF、CD44、EGFR和pRb的表达对预后的影响

随访患者68例，总的1年生存率、3年生存率、5年生存率分别为 82.35%、67.65%、61.76%。log－rank检验单因素分析年龄、分化程度、Laurén＇s分型、TNM 分期、VEGF、CD44 和EGFR是影响胃腺癌预后的因素。VEGF、CD44、EGFR阴性表达的胃腺癌组预后明显好于阳性表达组 (χ2值分别为7.42、15.72、16.96，p值均 ＜0.01)，生存率的比较见图6～9。年龄＜50岁、高/中分化、肠型和TNM分期I/II期的胃腺癌组预后明显好于年龄≥50岁、低分化、弥漫型和TNM分期III/IV期的胃腺癌组 (p值均＜0.05)。胃腺癌的术后生存率在CDX2、pRb阳性表达组和阴性表达组差别无统计学意义。

2.3 多因素COX回归分析

对于单因素分析有统计学意义的预后因素进行COX回归分析，结果显示EGFR、TNM分期、年龄、VEGF和分化程度为胃腺癌患者长期生存的独立影响因素。

2.4 TNM分期联合EGFR、CD44和VEGF的生存分析

根据TNM分期和EGFR、CD44、VEGF的表达情况，将本组病例分为6组，A组，TNM分期Ⅲ/Ⅳ期且EGFR、CD44和VEGF均为阳性表达的胃腺癌 (9例);B组，TNMⅢ/Ⅳ期且 EGFR、CD44和VEGF任意一种或两种蛋白阳性表达 (14例);C组，TNM分期Ⅲ/Ⅳ期且三种蛋白都阴性表达 (14例);D组，TNM分期Ⅰ/Ⅱ期且三种蛋白都阳性表达 (2例);E组，TNM分期Ⅰ/Ⅱ期且任意一种或两种蛋白阳性表达 (18例);F组，TNM分期Ⅰ/Ⅱ期且3种蛋白都阴性表达 (11例)。生存分析结果 (如图9)表明TNMⅢ/Ⅳ期的胃腺癌病例中C组预后好于A组和B组 (均p＜0.01)。

3 讨论

3.1 EGFR与预后

最近，由于靶向因子的开发，EGFR基因在人类各种恶性肿瘤的研究较为显著。在非小细胞肺癌中，已有文献很好的记载EGFR是不良预后因子［7－8］。EGFR表达的结直肠癌和食管腺癌患者预后也较差［9－10］。在非小细胞肺癌，EGFR过表达或大量EGFR基因拷贝数量的患者对EGFR靶向治疗有好的反应。在胃癌，表皮生长因子受体(EGFR)表达的预后和预测作用仍然是有争议的。EGFR在胃癌的阳性表达率，报道不一［4－6］，可能的原因包括:不同医院采集的标本、标本固定剂的不同、保存时间的差异、观察者之间的偏差以及免疫组化计分体系的不同。

笔者采用免疫组化评估了140例胃腺癌中EGFR蛋白的表达情况，EGFR阳性表达出现在45例 (32.1%)胃腺癌患者。生存分析表明EGFR是胃腺癌的独立预后因素，可能带来的价值是一部分患者将对EGFR靶向治疗敏感。

3.2 VEGF与预后

肿瘤的生长需要新生血管的形成，这种血管生成无疑打破了细胞增殖和凋亡的平衡。血管内皮生长因子超家族成员VEGF似乎在内皮细胞的增殖和迁移中起着重要的作用，为肿瘤的生长提供营养，使肿瘤细胞与宿主血管相延续。一些研究证明VEGF的表达是胃癌患者的独立预后因素［11－12］。本研究再次证实VEGF阳性表达的胃腺癌患者预后较差，多因素分析VEGF是胃腺癌的独立预后因素。

3.3 CD44与预后

最近，Takaishi等研究认为应用细胞表面分子CD44可证实胃癌干细胞，CD44阳性的胃癌细胞表现出自我更新和分化的能力并产生CD44阴性的细胞，CD44阳性的胃癌细胞表现出对化疗或放疗诱导的细胞死亡的耐受性增加［13］，提示CD44阳性表达的胃癌预后较差。

Ghaffarzadehgan等研究报道CD44在胃腺癌的表达率达到65%，在肠型胃癌表达较弥漫型胃癌更常见，CD44的表达与肠型胃癌的预后有关［14］。本研究中 CD44阳性表达的胃腺癌患者53例(37.9%)较之前的研究偏低，可能与收集的病例中肠型胃癌所占的比例偏低以及免疫组化计分体系不同有关。单因素生存分析CD44是影响胃癌预后的因素，CD44阳性表达的胃腺癌较CD44阴性表达的胃腺癌预后患者差，但多因素分析还不能认为CD44是独立预后因素。

3.4 CDX2、pRb与预后

Park等研究发现CDX2表达与肠型胃腺癌的浸润深度密切相关［15］，然而CDX2对于胃腺癌预后的影响研究较少。本研究发现CDX2的表达与Laurén＇s分型有关，其阳性表达率在肠型胃癌中明显高于弥漫型胃癌，生存分析不能证明CDX2与胃腺癌预后有关。

pRb是进入细胞周期的主要调控因子，控制G1－S期。Feakins等研究认为pRb表达的下降与胃腺癌不良预后相关［16］。本研究结果并无发现pRb与胃腺癌预后相关，可能的原因是免疫组化计分体系的不同，因此标准化的免疫组化评分系统是预后评估的关键。

3.5 EGFR、CD44、VEGF联合TNM分期对胃腺癌预后的影响

对单因素分析有预后意义的生物标记物联合检测，将具有回访资料的68例胃腺癌分为A组:EGFR、CD44和VEGF三者都阳性;B组:EGFR、CD44和VEGF三者中任意一种或两种表达;C组:EGFR、CD44和VEGF三者都阴性表达。研究表明三组生存率的差别有统计学意义，其中C组的预后最好，A组的预后最差。同一TNM分期如TNMⅢ/Ⅳ期的胃腺癌病例，EGFR、CD44和VEGF三者都阴性表达的病例预后好于三者都阳性表达和其中任意一种或两种表达的病例。因此，EGFR、CD44和VEGF联合检测能够较好的区分处于不同疾病风险的TNMⅢ/Ⅳ期胃腺癌病例，为个体化治疗提供了依据。

表1 胃腺癌CDX2、VEGF、CD44、EGFR、pRb的表达与临床病理特征的关系

图1 胃中分化腺癌，CD44在肿瘤细胞膜阳性表达 (En-Vision法 ×400)

图2 胃低分化腺癌，EGFR在肿瘤细胞膜阳性表达 (En-Vision法 ×400)

图3 胃中分化腺癌，pRb在肿瘤细胞核阳性表达 (EnVision法 ×400)

图4 胃中分化腺癌，VEGF在肿瘤细胞质阳性表达 (En-Vision法 ×400)

图5 胃低分化腺癌，CDX2在肿瘤细胞核阳性表达 (En-Vision法 ×400)

图6 EGFR阳性表达与阴性表达组的生存曲线比较

图8 VEGF阳性表达与阴性表达组的生存曲线比较

图9 TNM分期结合EGFR、CD44、VEGF阳性或阴性表达组的生存曲线比较

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