生产性制备多克隆抗体诱发载体选择家兔的可行性研究*

颜瑞巧 江洪涛 李卫东

(1.九江学院附属医院;2.江西省系统生物医学重点实验室 江西九江 332000))

在人抗兔多克隆抗体生产性制备中，兔的选择是极其重要的环节。随着普通级实验兔养殖费用不断攀升及供求矛盾的日益突出，在保证人抗兔多克隆抗体质量和数量的前提下，为了节省有限的普通级实验兔资源，同时降低生产成本，选择家兔作为诱发载体的可行性研究具有实际意义。目前针对这个问题的研究文献较少，本研究利用合成多肽采取同样条件对普通级实验兔和家兔进行免疫，对获得的相应抗体质量和数量进行对比研究，探讨家兔作为诱发载体的可行性。

1 材料和方法

1.1 用兔和分组

动物分成两组U组 (普通级实验兔)，T组(家兔)，每组30只，U、T均采用同样的饲养方式和免疫方式。U组由南昌龙平兔业有限公司(生产许可证:SCXK(赣)2009－0001)提供普通级日本大耳兔雌雄各半，T组由市郊农户提供雌雄各半日本大耳兔。

免疫前检验主要包括皮毛 (尤其是腹部)、体重、外观、品系及免疫记录等一般状态，入检疫区饲养1周，检疫合格后每只兔耳静脉采血2mL，用Westen－blot检测血中已有抗体的状态，检测显示普通级实验兔与家兔血清背景状态并无差异，淘汰比率相同，见图1。

图1 部分兔血清Westen－Blot结果，左侧为T组T1－4、T2－3、T3－2不合格;右侧为U组U1－2、U2－2、U2－3不合格

1.2 免疫材料和方法

1.2.1 抗原 采用化学交联的方法［1］将60种合成的多肽分别交联到匙孔槭血蓝蛋白 (keyhole limpet hemocyanin，KLH)上，经交联的多肽作为抗原物质。

1.2.2 佐剂、乳化和免疫方法 首次免疫D的方法:弗氏完全佐剂0.4mL与1mg/mL的抗原0.3mL混合上自动乳化机 (自制)乳化2h，检查乳化效果，兔腹部皮下多点 (20点)注射。首免后第21d进行二次免疫，方法:弗氏不完全佐剂0.35mL与1mg/mL的抗原0.25mL混合上自动乳化机乳化2h，检查乳化效果，兔腹部皮下多点(20点)注射。二免后第21d实施三次免疫，方法同二免。

2 结果和分析 两组三免后血清量及效价比较情况见表1。

表1 两组三免后血清量及效价比较

由表1可知:①普通级实验兔和家兔血清背景检测差异无统计学意义 (p＞0.05)。②两种兔三免后抗体效价差异无统计学意义 (p＞0.05)。③两种兔单位体重诱发抗体冻干物重量差异无统计学意义 (p＞0.05)。

3 讨论

选择实验动物时应考虑以下原则:近似性原则，差异性原则，易化原则，相容和匹配原则，可获性原则，重复性和均一性原则［2］。在免疫学研究中选择实验动物时需特别注意实验动物的遗传背景、实验动物的年龄，因不同种属和品系实验动物的免疫反应有很大的差异，年龄影响实验动物的免疫机能［3］。在大量生产性制备多克隆抗体中更加注重可获得性原则、兔龄、体重和皮毛的健康状态。

家兔在免疫学研究领域常用来生产抗体、制备高效价和特异性强的免疫血清，其制品广泛地应用于人、畜各类抗血清和诊断血清的研制，如病原体血清，间接免疫血清、抗补体抗体血清和抗组织免疫血清等。家兔有特殊的血清型和唾液型，根据血细胞型凝集素的有无，兔可分为4个血清型，即 α＇、β＇、α＇β＇、O 型，兔的 α＇、α＇β＇血清型易产生人血细胞A型抗体，而β＇、O血清型易产生人血细胞B型抗体;兔的唾液己确认有两型，即易获得人血细胞A型物质者，称排出型，不易获得人血细胞A型物质者，称非排出型。唾液中有无A型物质与A型抗体产生能力有密切关系，欲使之产生A型抗体，应选用非排出型中的α＇、α＇β＇血清型兔［4］。

多克隆抗体的质量主要决定于抗原的设计和后期纯化，但免疫过程将直接影响抗体质量和数量。在免疫前兔血清本底是否清晰会增加纯化的难度，在免疫前兔血中已经产生与所诱发抗体非常接近的抗体，这将直接影响纯化过程，使目标抗体产量和质量均受到一定程度的影响。但随着生产级别的纯化工艺和技术不断改善，在混杂的粗提物中纯化目标抗体的纯化技术越来越成熟，对诱发抗体的动物要求相对降低。本研究中结果差异无统计学意义的原因可能是普通级实验兔的质量标准并不完全针对生产性诱发抗体用兔。生产性抗体诱发主要关注兔血清中已经产生抗体的数量和种类，这对抗体的后期纯化带来一定的影响。本次使用的普通级实验兔，在生产时各种原因造成兔质量下降，这也可能成为结果差异无统计学意义的原因。

理论上采用清洁级实验兔用于抗体制备肯定优于其它级别的兔，在少量制备研究用珍贵抗体还是值得选择清洁级实验用兔，在大量生产性制备兔多克隆抗体的过程中全部选用清洁级实验兔显然不实际，选择普通级实验兔也难以满足生产需要，选用规范养殖的家兔制备大量兔多克隆抗体是比较实际的办法，也是一个值得探讨的内容。

［1］(美)奥斯伯·艾主编，金由章艾译校．精编分子生物学实验指南 ［M］．北京:科学出版社，2001.437．

［2］苗明三．实验动物和动物实验技术 ［M］．北京:中国中医药出版社，2002.489．

［3］施正良，刘之理．生物医学中的实验动物选择与应用 ［J］．实验动物与动物实验，1994，6(2):20.

［4］牛泽清，赵勇．实验动物在免疫学研究领域中的应用 ［J］．实验动物科学与管理，2005，22(3):43．