珍菊降压片微生物限度检查方法的验证

姚 萍 江苏省徐州医药高等职业学校 （徐州221116）

珍菊降压片由野菊花膏粉，珍珠母粉，盐酸可乐定，氢氯噻嗪，芦丁组成。是降压药中的一种，用于高血压症。

微生物限度检查法主要是指检查非规定制剂和其原、辅料受微生物污染程度的一种方法，其具体的检查项目主要包括细菌数、霉菌数、酵母菌数以及控制菌的检查。每个具有抑菌作用的药品的抑菌效果不同，所以适合各个药品的微生物限度检查法也不相同。《中国药典》2010年版中明确的规定，所有的药品在进行微生物限度的检查之前必须对其检查的主要方法进行科学的验证，以确认供试品所采用的检查方法没有抑菌作用之后才能够对其进行检查，只有这样，才能够真实的反映出供试品所受到污染的具体程度。本研究采用常规法对珍菊降压片的微生物限度检查进行了科学的方法学验证，以最大限度的确保该微生物限度检查方法的有效性，为更好地控制本制剂的质量提供科学的依据和方法。

1 实验材料 1.1 培养基 运用批号为090919的营养琼脂培养基，批号为090606的玫瑰红钠琼脂培养基，批号为090528的胆盐乳糖培养基，批号为090111的营养肉汤培养基，批号为090413的pH值为7.0的无菌氢氧化钠－蛋白胨缓冲液，批号为090408的改良马丁培养基，MUG培养基（批号091008），胆盐乳糖发酵培养基（批号09218），均为中国药品生物制品检定所提供。

1.2 实验仪器 运用吴江市金家坝医药净化设备厂所生产的医用净化工作台，上海跃进医疗器械一厂所生产的电热恒温培养箱，广东省医疗器械厂所生产的生化培养箱，天津实验仪器厂所生产的电热恒温鼓风干燥箱，以及上海博迅实业有限公司医疗设备厂所生产的立式压力蒸汽灭菌器等。高压蒸汽灭菌锅、天平、净化间、净化工作台、恒温生化培养箱过滤器。

1.3 菌种 本项研究的菌种主要为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠球菌以及黑曲霉等，所有的研究菌种均是由中国药品生物制品检定所提供的。

1.4 样品 珍菊降压片（批号101201，常熟华葆制药有限公司）。

2 实验方法 2.1 菌液的制备 首先，将本项研究的主要菌种，包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌等的新鲜培养物接种到营养肉汤培养基中，以30～35℃的温度培养18～24h之后，运用0.9%无菌氯化钠溶液，将各菌种分别置于溶液中进行10倍系列的稀释，之后将其制成50～100cfu·mL－1的菌悬液。其次，将白色念珠菌的新鲜培养物接种在改良的马丁琼脂培养基之中，并以23～28℃的温度来对于进行培养，在培养24～48h之后，运用用0.9%无菌氯化钠溶液将其制成50～100cfu·mL－1的菌悬液。第三，将黑曲霉的新鲜培养物接到改良的马丁琼脂斜面培养基之中，并以23～28℃的温度来对其进行培养，在培养5～7d，之后，当大量孢子产生后，加入0.9%无菌氯化钠溶液3～5mL，将孢子洗脱。接下来，吸出孢子悬液，并将吸出孢子悬液放置于无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液将其制成50～100CFU的孢子悬液。

2.2 供试品溶液的制备 从两个不同包装单位中各取本品5g（共10g），加pH 7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液至100mL，用匀浆仪搅匀，制成1∶10均匀供试液。

2.3 方法验证

2.3.1 细菌、霉菌和酵母菌计数的验证（平皿法）

2.3.1.1 试验组：取2.2项下所制备出来的的供试液1mL以及菌悬液1mL，并将其共同注入到1个灭菌平皿中，之后，将其迅速的倒入15～20mL营养琼脂培养基中，平行制备两个平皿，待凝。分别制作含金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢菌、白色念珠菌的试验组，细菌在30～35℃培养箱中培养48 h；霉菌和酵母菌在23～28℃培养箱中培养72h，点计菌落数。取均值。

2.3.1.2 菌液组：取金黄色葡萄球菌菌悬液、大肠埃希菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液，并将其分别注入到2个平皿之中，之后立即将营养琼脂培养基倾注其中，并将其置于30～35℃的培养箱中进行培养，以24～48h的时间来计数。

取含菌量为50～100cfu的白色念珠菌菌悬液，分别注入2个平皿，置于23～28℃培养箱中培养48～72h计数。

2.3.1.3 供试品对照组

取1∶10供试液1mL加入到平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，平行制备2平皿，置于30～35℃培养箱中培养24～48 h计数；

取1∶10供试液1mL加入到平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，平行制备2平皿，置于23～28℃培养箱中培养48～72h计数。

2.3.2 细菌菌落总数计数方法的验证（采用培养基稀释法）

2.3.2.1 试验组：将比例为1∶10供试液0.5mL以及含菌量为50～100cfu的金黄色葡萄球菌悬液分别注入平皿之中，然后，立即将营养琼脂培养基倾注其中，应该为其平行制备4个平皿，并将其置于30～35℃的培养箱中培养24～48h计数。

2.3.2.2 菌液组：用含菌量为50～100cfu的金黄色葡萄球菌菌悬液分别注入到2个平皿之后，之后，立即将营养琼脂培养基倾注其中，并将其置于30～35℃培养箱中，对其进行培养24～48h计数。

2.3.2.3 供试品对照组：将1：10比例的供试液1mL加入到平皿之中，之后，立即将营养琼脂培养基倾注其中，再平行制备2个平皿，并将其置于30～35℃培养箱中进行为期24～48h的培养。

将比例为1∶10的供试液1mL加入到平皿之中，之后，立即将玫瑰红钠琼脂培养基倾注其中，平行制备2个平皿，并将其置于23～28℃的培养箱中培养48～72h计数。

2.4 控制菌检查方法验证

2.4.1 菌液制备的主要方法：将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等的新鲜培养物接种到营养肉汤培养基之中，并以30～35℃的温度来对其进行培养，培养的具体时间为18～24h，之后，将0·9%无菌氯化钠溶液注入到各菌种之中，再运用10倍系列将其稀释之后，最终制成50～100cfu·mL－1的菌悬液。

2.4.2 供试品操作过程：从两个不同包装的供试品单位中量取各5g（共10g）的样品，并将其加入到pH值为7.0的氯化钠－蛋白胨缓冲液100mL中，运用匀浆仪进行搅匀，并最终将其制成比例为1∶10的均匀供试液。

2.4.3 试验组：取1∶10供试液10mL及50～100cfu·mL－1的大肠埃希菌菌液接种至100mL胆盐乳糖培养基，置于35～37℃培养箱中培养18～24h。

2.4.4 阴性菌对照组：取1∶10供试液10mL及50～100 cfu·mL－1的大肠埃希菌菌液接种至100mL胆盐乳糖培养基，置于35～37℃培养箱中培养18～24h。

2.4.5 MUG检查：取0.2mL的上述培养物，病将其接种到含5mLMUG培养基的试管之内，在35～37℃温度的培养箱中进行培养，分别在培养的5h，24小时在366nm紫外线下对其培养的过程进行细致的观察。观察之后，两试管各加入靛基质试剂数滴。

2.5 大肠菌群检查方法验证

2.5.1 试验组：取1∶10供试液1mL及10～100cfu的大肠埃希菌菌液接种至10mL胆盐乳糖发酵培养基，置于35～37℃培养箱中培养18～24h。

2.5.2 阴性菌对照组：取1∶10供试液1mL及10～100 cfu的金黄色葡萄球菌菌液接种至10mL胆盐乳糖发酵培养基，置于35～37℃培养箱中培养18～24h。

3 实验结果 珍菊降压片微生物限度检查方法相关的试验结果为细菌计数，其主要采用药典附录上所进行的培养基稀释法；而霉菌和酵母菌计数则采用的是药典附录中的平皿法，控制菌检查所采用的是药典附录中所提及的控制菌检查方法。

3.1 试验组菌回收率 试验组菌回收率＝（试验组菌落数－供试品对照组菌落数）/菌液组菌落数×100%，见下表。

表1 各组试验组菌回收率

由上表数据可知，大肠埃希菌试验组的平均回收率为89.3%，枯草芽孢杆菌试验组的平均回收率为87.9%，白色念珠菌试验组的平均回收率为79%，而黑曲霉试验组的平均回收率则为86.7%，可知本品对大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉无抑菌作用；金黄色葡萄球菌试验组平均回收率为59.3%，可知本品对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌活性。

由此说明本品可以按照平皿法哎进行霉菌、酵母菌总数菌落计数；而不可以按照平皿法哎进行细菌总数计数。

3.2 金黄色葡萄球菌回收率计算方法同上，见表2

表2 各组金黄色葡萄球菌回收率

本品按照培养基稀释法进行细菌总数计数方法验证，金黄色葡萄球菌试验组的平均回收率为88.6%，说明本品可以按照培养基稀释法来进行细菌菌落计数。

3.3 试验组MUG阳性，靛基质阳性，判检出相应的大肠埃希菌。阴性菌对照 MUG阴性，靛基质阴性，判未检出任何的大肠埃希菌。

3.4 试验组胆盐乳糖发酵管产酸产气，阴性菌对照组胆盐乳糖发酵管未产酸产气，将发酵管中的培养物分别划线接种与曙红亚甲蓝琼脂（EMB）培养基的平板上，培养18～24h。试验组平板上见典型大肠埃希菌菌落生长，阴性菌对照组平板上未见菌落生长。

试验组的胆盐乳糖发酵培养基管呈阳性结果，在EMB平板上见典型大肠埃希菌菌落，判检出大肠菌群。阴性菌对照组的胆盐乳糖发酵培养基管呈阴性结果，判未检出大肠菌群。

4 讨 论 由于珍菊降压片是一种含有多种成分的复方中成药制剂，该项药物中的任何具有抑菌作用的相关成分均可以对微生物限度检查的准确性产生影响。以本品细菌计数常规法的结果为主要的依据，必须采取其他的有关试验方法来去除药物的抑菌作用才能够较为真实的反映出该项药物的受污染程度。本项研究所运用的培养基稀释法可以较为显著的提高菌落的检出率。相关的实验表面，珍菊降压片对白色念珠菌和黑曲霉均无较为明显的抑菌作用，所以，霉菌和酵母菌计数通常都会采用常规法。此外，珍菊降压片对大肠埃希菌也无明显的抑菌作用，控制菌检查阳性对照组生长状况良好，阴性菌对照组则没有检出，所以，其控制菌检查所采用的同样是常规法。

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