醋制南五味子抗α－淀粉酶活性部位筛选＊

2012-07-09蒙跃龙董彬厂陕西中医学院药学院咸阳712046

陕西中医 2012年11期

蒙跃龙董彬厂邓翀陕西中医学院药学院（咸阳712046）

南五味子为木兰科华中南五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的果实，有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的作用。炮制方法主要有醋制、酒制、蜜制、炒制、蒸制等。生品以敛肺止咳为主，用于自汗盗汗，口干作渴；醋制后增强酸涩收敛之性。近几年文献报道五味子具有抗糖尿病的生理活性。西方医学通过化学合成法寻找α－淀粉酶抑制剂取得了一定进展，但合成药物对糖尿病患者的耐药性与副作用也日益明显，寻找安全、有效的天然α－淀粉酶抑制已被提上日程。本研究采用酶法测定南五味子炮制前后不同化学部位对α－淀粉酶抑制活性，为五味子辅助降糖新药研发提供一定的依据。

1 试药和仪器

1.1 药材南五味子购于陕西南郑县，经王继涛高级实验师鉴定为木兰科华中南五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的成熟果实。

1.2 试剂试液 α－淀粉酶（北京奥博星生物技术有限公司，20120205）；可溶性淀粉（天津市天力化学试剂有限公司，批号20110308）；阿卡波糖（天津西玛科技有限公司，批号20120301）；3，5－二硝基水杨酸（上海科丰化学试剂有限公司，批号20101009）3，5－二硝基水杨酸试液（取3，5－二硝基水杨酸6.5g加入325mL的2mol·L－1氢氧化钠和45mL丙三醇，再加入蒸馏水至1000mL，充分溶解，室温存放备用）；0.2mol·L－1PH＝5.6柠檬酸缓冲溶液、0.12mol·L－1PH＝6.1磷酸盐缓冲溶液，其它试剂均为分析纯。

1.3 仪器 UV1102型紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司），FA2004N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）PHS－3C型雷磁精密PH计。

2 方法

2.1 南五味子各提部位的制备称取炮制前后南五味子药粉各10g，分别以氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水10倍量溶剂各提取两次，每次1h，合并各溶剂滤液并蒸干。氯仿和乙酸乙酯提取部位均用无水乙醇溶解并转移置25mL量瓶中定容；正丁醇提取部位用80%乙醇溶解并转移置25mL量瓶中定容（将定容后的炮制前后正丁醇提取部位溶液稀释十倍再进行测定）；水提取部位用蒸馏水溶解转移置100mL量瓶中定容，将制备好的各样品提取部位溶液密封4℃冷藏放置，待用。

2.2 α－淀粉酶活性的测定原理采用3，5－二硝基水杨酸方法（3、5－dinitrosalicylic acid、colorimetric assays，Bernfeld method）测定α－淀粉酶活性，Bernfeld法是通过确定可溶性淀粉在α－淀粉酶作用下水解产生的还原基团将3，5－二硝基水杨酸还原为硝基氨基水杨酸（棕红色物质），还原基团的量与棕红色物质颜色深浅程度成一定的比例关系，在波长520 nm处测定棕红色物质和阳性对照阿卡波糖的吸光值（A）[1]，由于α－淀粉酶抑制剂对淀粉水解有抑制作用，可使A520值下降，从而可以计算待测物对淀粉酶活性的抑制率。

2.3 南五味子各提取部位抑制α－淀粉酶活性的测定方法设α－淀粉酶管、各不同提取部位管、阳性对照管、α－淀粉酶空白对照管、各提取部位空白对照管、阳性对照空白管。炮制前后各提取部位管中加入0.4mL提取液挥干溶剂并加0.4mL磷酸盐缓冲溶液溶解后，加入0.4mL柠檬酸缓冲液、0.8mL 8mg·mL－1淀粉溶液[2]（用柠檬酸缓冲溶液配制）、2mL 4mg·mL－1α－淀粉酶液[3]，总反应体积为3.6mL。

将各管内溶液混匀，37℃水浴保温30min后，分别加入6mL 3，5－二硝基水杨酸溶液，摇匀，置于100℃水浴保温10min，冷却置室温，分别取各管反应液1mL加入9mL蒸馏水于520nm处检测吸光度值（A）。

α－淀粉酶抑制率计算公式如下：