替罗非班早期干预对非ST抬高型急性冠脉综合征患者MMP－9与sCD40L 表达的影响

张利峰，王光辉，张俊芳，王桂东

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是危害人类健康的常见心血管疾病，是引起死亡的主要原因之一，目前认为AS是一种炎症性疾病，其发生、发展的各个阶段符合慢性炎症的表现[1]。近年来CD40和CD40配体（CD40ligand，CD40L）在AS发生和斑块稳定性中的作用日益引起人们的重视。急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）有共同的病理生理，即冠状动脉粥样斑块破裂，形成血栓，使冠状动脉血管部分或完全闭塞，导致心肌缺血或梗死。而血小板的活化、黏附和聚集是动脉血栓形成过程中的关键步骤。激活的血小板释放的可溶性CD40配体（sCD40L）对研究ACS的发生、发展具有重要价值[2]。基质金属蛋白酶（MMPs）是一种依赖Zn2＋和Ca2＋的酶家族，能特异性地与细胞外基质各成分相结合，并降解胞外基质。MMPs的活性与斑块不稳定性密切相关，其中以基质金属蛋白酶－9（MMP－9）关系最为密切[3，4]。

本研究选择非ST抬高型急性冠脉综合征患者，采用替罗非班干预，观察对MMP－9、可溶性CD40配体（sCD40L）的影响，进一步探讨替罗非班对斑块稳定性和抑制免疫炎症的可能机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2011年1月—2011年5月本院心内科ACS患者120例，其中男60例，女60例，年龄42岁～75岁。全部病例达到不稳定型心绞痛或非ST段抬高型急性心肌梗死诊断标准，并且TIMI评分在3分以上为入选标准。排除各种急慢性感染性疾病、糖尿病酮症、肾脏、肝脏疾患、Graves病、肺间质纤维化、结缔组织病及肿瘤、外周血管病和脑血管病。将上述患者随机分为常规治疗组与替罗非班组，年龄分别为（55.1±8.9）岁、（52.5±9.8）岁，差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 全部病例行常规治疗，包括抗血小板、抗凝、扩冠治疗；常规治疗未应用替罗非班，替罗非班组加用替罗非班（欣维宁，武汉远大制药），用量根据体重计算，起始推注剂量为10μg/kg，在3 min内推注完毕，而后以0.15μg/（kg·min）的速率维持滴注，维持量滴注持续36 h。

1.2.2 检测方法 常规治疗组次日清晨抽血，应用替罗非班组12 h、24 h、36 h分别抽取患者血液标本3mL，立即注入预先加有无菌3.8%枸橼酸钠0.2mL的抗凝管中备用。分离血单一核细胞：按文献[5]进行。按Trizol试剂盒说明书提取总RNA，将RNA在－70℃保存待测[6]。然后进行逆转录－聚合酶链反应，紫外凝胶图像分析仪进行数据分析，以目的基因mRNA扩增后产物的光密度值与内参照GAPDHmRNA扩增后产物光密度值的比值作为mRNA表达的相对值。sCD40L、MMP－9及内参GADPH的引物序列见表1。

表1 MMP－9和sCD40L的引物序列

2 结 果

替罗非班同时抑制MMP－9与sCD40L的表达，其作用亦呈时间依赖性。与常规治疗相比，应用替罗非班后12 h、24 h、36 h MMP－9的表达降低50%、73%和82%；sCD40L的表达降低32%、69%和88%，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表2。

表2 替罗非班对MMP－9、sCD40L表达的影响（±s）

表2 替罗非班对MMP－9、sCD40L表达的影响（±s）

与常规治疗相比，1）P＜0.05

MMP－9m RNA sCD40LmRNA常规治疗组 1.146±0.006 1.312±0.017组别替罗非班组12 h 0.878±0.0951） 1.118±0.0271）24 h 0.704±0.0131） 0.702±0.0221）36 h 0.502±0.0071） 0.492±0.0091）

3 讨 论

动脉粥样硬化的本质是慢性炎症过程，单核/巨噬细胞是AS斑块形成中最重要的细胞之一。CD40受体与CD40配体（CD40L）是一对互补跨膜蛋白，分别属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）和TNFR超家族成员，几乎可在人AS病变中所有的细胞类型（如巨噬细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞）中表达[2]。临床研究发现，不稳定心绞痛组外周血可溶性CD40L水平、T细胞与血小板膜表面CD40L明显高于稳定心绞痛组与对照组，血清sCD40L浓度明显升高者继发生心肌梗死、中风或心血管死亡率明显增高，而对照组没有心血管疾病发生[7]。体内及体外的研究证实，不论是自身、局部或外源性的CD40L均可刺激粥样斑块相关细胞（淋巴细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞）表达和产生一系列与斑块发生、斑块破裂和血栓形成有关的活性物质，如黏附分子、细胞因子、基质金属蛋白酶、组织因子等。基质金属蛋白酶是一种依赖Zn2＋和Ca2＋的酶家族，能特异性地与细胞外基质各成分相结合，并降解胞外基质。近年来的研究发现[4]，不稳定斑块，尤其是易发生破裂的斑块“肩部区域”，MMP－9的蛋白及酶活性明显增加，较稳定斑块高3倍～5倍，且这种 MMP－9的增加主要来源于斑块内的巨噬细胞。多数学者认为，MMP－9能促进急性冠脉综合征的发生、发展，在临床上可以作为斑块的活动性标志。

大量临床试验证明，抗血小板药物在动脉粥样硬化相关疾病中能够降低血管事件的发生率和病死率。传统观念认为，这主要得益于抗血小板药物抑制血小板聚集和血栓形成的作用。然而，近年来国内外为数不多的研究显示，抗血小板药物除能减少血栓形成外，还具有抑制动脉粥样硬化斑块进展的作用[8，9]。替罗非班是抗血小板聚集的药物，作用于血小板聚集的最后阶段，即它阻断了血小板表面Ⅱb/Ⅲa受体，抑制了纤维蛋白原形成。那么，它除了抑制血小板聚集，是否还通过其他的机制治疗靶病变呢？国外已有体外实验证明，替罗非班能够降低激活的血小板和内皮细胞之间相互作用后产生MMP－2和MMP－9[10]。本研究发现替非罗班可明显抑制sCD40L与MMP－9表达，其作用有时间依赖性，这与已有的报道结果相吻合。与常规治疗组相比，应用替罗非班后12 h、24 h、36 h后MMP－9的表达降低50%、73%和82%；sCD40L的表达降低32%、69%和88%，有统计学意义（P＜0.05）。由此可以看出sCD40L与MMP－9表达变化的趋势一致。因此，对 MMP－9的抑制可能是通过拮抗CD40/CD40L通路来实现的，从而具有抑制炎症、稳定粥样斑块作用，但其作用的靶点和具体信号转导机制尚不明确。赵永平等[11]研究发现PPARγ有可能通过阻断CD40/CD40L而对冠脉具有保护作用，是CD40－CD40L信号通路的上游调节机制，但尚需进一步研究。

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