六味降抗合剂的制备与临床应用

于东平，张军红，孙 建

六味降抗合剂是山东省食品药品监督管理局批准生产的医院制剂(鲁药制字Z07080052)，由茵陈、黄芩、大黄、益母草、白芍、木香6味药物组方，具有清热解毒、利湿退黄、调和气血的作用，用于既往有流产、死胎或新生儿溶血症的患者此次妊娠母儿血型不合者，血清血型抗体滴度大于1∶64，且有新生儿溶血症可能的孕妇，疗效较好。现将制备方法、质量控制及临床应用报道如下。

1 仪器与试药

三用紫外分析仪(上海康华生化仪器制造厂);PHS－3F型数字显示式酸度计(上海电子光学技术研究所);TG－328A型分析天平(上海长江科学仪器厂);Waters486型高效液相色谱仪(美国Waters公司)。六味降抗合剂(本院制剂科自制);黄芩苷对照品、绿原酸对照品、去氢木香内脂对照品、木香烃内脂对照品、芍药苷对照品、大黄对照药材 (中国药品生物制品检定所，批号分别为110715－200514，110753－200413，111525－200505，111524－200503，110736－200629，120984);其他所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 处方与制备

处方:茵陈 84 g，黄芩84 g，大黄61 g，益母草 169 g，白芍68 g，木香34 g，制成1 000 mL。

制备:以上6味药，加水浸泡1h，煎煮3次，每次1h，合并煎液，静置24 h，取上清液浓缩至近1 000 mL，过滤，加水至1 000 mL，灌装，灭菌，即得。

2.2 质量控制

2.2.1 性状

本品为深棕色液体，味微苦，微有沉淀。

2.2.2 TLC 鉴别

益母草[1]:取本品30 mL蒸至稠膏，加80%乙醇50 mL，加热回流30 min，滤过。取滤液20 mL，蒸至稠膏，残渣加1%盐酸溶液5 mL使溶解，滤过。取滤液分置于3支试管中，每支1 mL，一支加碘化铋钾试液1～2滴，产生橙红色沉淀;一支加碘化汞钾试液1～2滴，产生黄白色沉淀;另一支加硅钨酸试液1～2滴，产生灰白色沉淀。取滤液1 mL，加醋酸铅试液2～3滴，即产生桔黄色沉淀;另取滤液1 mL，加镁粉少量与盐酸3～4滴，显红色。

黄芩[1，3]:取本品1 mL，加75%乙醇溶液5 mL，摇匀，作为供试品溶液。另取黄芩苷对照品，加75%乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按处方除去黄芩制成阴性样品，按供试品溶液方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2]试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯－丁酮－醋酸－水(10∶7∶5∶3)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图1 A。

茵陈[1]:取本品20 mL，加枸椽酸调pH至3.0以下，用醋酸乙酯萃取4次，每次20 mL，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣加乙醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。另取绿原酸对照品，加乙醇制成1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按处方除去茵陈制成阴性样品，按供试品溶液方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2]试验，吸取上述2种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯－甲酸－水(10∶2∶1)为展开剂，展开，展距为8～9 cm，取出，晾干，在紫外光灯(365 nm)下检视，供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图1 B。

大黄[2，3]:取本品 20 mL，加盐酸 2 mL，置水浴上加热 30 min，放冷，用乙醚振摇提取两次，每次20 mL，合并乙醚液蒸干，残渣加氯仿2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0.1 g，同法制成对照药材溶液。按处方除去大黄制成阴性样品，按供试品溶液方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2]试验，吸取上述两种溶液各4μL，分别点于同一以羧甲基纤维素纳为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同的5个橙黄色荧光斑点;置氨蒸气中熏后，日光下检视，斑点变为红色。见图1 C。

图1 薄层色谱图

木香[2]:取本品5 mL，加三氯甲烷10 mL，超声处理30 min，取三氯甲烷层，作为供试品溶液。另取去氢木香内脂对照品、木香烃内脂对照品，分别加三氯甲烷制成每1 mL含0.5 mg溶液，作为对照品溶液。按处方除去木香制成阴性样品，按供试品溶液方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2]试验，吸取上述3种溶液各5μL，分别点于同一以羧甲基纤维素纳为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－环己烷(5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图1 D。

白芍[2－3]:取本品 5 mL，加乙醇 10 mL，振摇 5 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg溶液，作为对照品溶液。按处方除去白芍制成阴性样品，按供试品溶液方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2]试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸(40 ∶5 ∶10 ∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。见图1 E。

2.2.3 检查

相对密度:应为 1.02～1.12[2]。

pH:应为 4.5 ～6.0[2]。

其他:应符合《中国药典(一部)》附录合剂项下的各项规定[2]。

2.2.4 含量测定

照高效液相色谱法[2]测定。色谱条件和系统适应性试验:色谱柱 C18(250 mm ×4.6 mm，5μm)柱;流动相:甲醇－水－磷酸(47 ∶53 ∶0.2);流 速:1.0 mL/min;柱温:25 ℃;检测波长:280 nm。按色谱条件，分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各5μL进样检测。结果黄芩苷色谱峰峰形对称，与基线分离，阴性对照品溶液对黄芩苷色谱峰无干扰。高效液相色谱图见图2。

图2 高效液相色谱图

对照品溶液的制备:精密称取黄芩苷对照品6 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇适量，水浴中振摇使其溶解，放置至室温，加甲醇至刻度，摇匀，吸取上述溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得(每1 mL含黄芩苷0.06 mg)。

供试品溶液的制备:精密量取本品10 mL，烘干，加70%乙醇40 mL，加热回流30 min，放冷，滤过，滤液置100 mL量瓶中，用少量70%乙醇分次洗涤残渣和容器，洗液滤入同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

阴性对照品溶液的制备:取处方中除黄芩外的其他药材，按制剂工艺制备，按供试品溶液的制备方法制得阴性对照品溶液。

线性关系考察:分别精密量取黄芩苷对照品溶液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μL，进样检测。记录色谱峰面积，以进样量为横坐峰，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程 Y=233 437.8X－27 943.84，r=0.999 9，结果表明，黄芩苷进样量在 0.12 ～0.60 μg范围内与峰面积有良好线性关系。

精密度试验:精密吸取黄芩苷对照品溶液，进样6次，每次进样5μL，测得色谱峰面积 RSD为0.5%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:精密吸取供试品溶液，分别于 0，2，4，6，12，24 h时进样10μL，测得峰面积的 RSD为0.5%，说明黄芩苷在室温条件下24 h内稳定。

重复性试验:取供试品5份(批号为090107)，分别制备供试品溶液，测定峰面积，结果黄芩苷的 RSD为1.02。说明本办法重复性良好。

回收率试验:取已知黄芩苷含量的供试品6份(批号为090107，黄芩苷含量为 0.102 5 g/L)，各精密量取 1 mL，烘干，再分别精密加入一定量的黄芩苷对照品溶液，按供试品溶液的制备方法制备加样回收供试品溶液，分次精密吸取5μL，进样检测。结果见表1。

表1 黄芩苷加样回收试验结果(n=6)

样品含量测定:精密量取3批样品各10 mL，按供试品溶液的制备方法制得，精密吸取5μL，进样，按上述色谱条件检测。记录峰面积，由回归方程计算黄芩苷的含量(本品黄芩苷含量不得低于 0.075 6 g/L)，结果见表 2。

表2 黄芩苷样品含量测定结果

2.3 临床应用

2.3.1 病例选择标准

1)孕妇既往有流产、死胎及新生儿溶血症分娩史，此次妊娠母儿血型不合者。2)夫妇Rh血型不合，孕妇为Rh阴性，丈夫为Rh阳性。3)孕妇血清免疫学检查符合下列标准:部分中和定量commbs试验不小于1∶64;溶血素不小于1∶8;抗体滴度胶体法IgG抗D或抗E不小于1∶64。符合以上标准的30名孕妇服药前共妊娠91次，其中人工流产15次，自然流产6次，分娩71次，娩出新生儿患溶血症64次(90%)，新生儿死亡57例(89.1%)。

2.3.2 治疗方法

孕妇自妊娠16周起口服六味降抗合剂至分娩，每次50 mL，早、晚各1次。

2.3.3 结果

血清免疫性抗体滴度的变化:治疗前抗体滴度1∶64者4例，1∶128者 10例，1∶256者 8例，1∶512者 6例，1∶1 024者 2例。治疗后抗体滴度1∶64者11例，1∶128者13例，1∶256者6例。用药后免疫性抗体滴度的动态变化上升者1例，无变化者11例，下降者17例，无变化和下降者占93%。

新生儿发病情况:共娩出新生儿溶血症患儿17名，发病率为56.6%，死亡率为0，与服药前发病率(90%)及死亡率(89.1%)相比，P ＜0.01，有显著性差异。

新生儿72 h内血清胆红素含量比较:经药物治疗的30名孕妇娩出的新生儿72 h内血清胆红素不大于205μmol/L者12例(正常范围)，大于205μmol/L者 18例，大于340μmol/L者4例，最高者为350μmol/L。30例中有既往新生儿情况记载的21名，新生儿72 h内血清胆红素全部大于340μmol/L，最高者达750μmol/L，对治疗前后娩出的新生儿72 h内血清胆红素含量进行比较，经统计学处理，P＜0.01，有显著性差异。

孕妇血清免疫性抗体滴度与新生儿发病的关系:新生儿患病组18例，其抗体滴度为1∶64者2例，1∶128者10例，1∶256者6例;非患病组12例，抗体滴度为1∶64者8例，1∶128者4例，经统计学处理，P＜0.05，有显著性差异。

3 讨论

妊娠母儿血型不合导致的溶血现象，中医认为是热毒侵袭，湿热内蕴、气血紊乱所致，以清热泻火解毒、利湿退黄、调和气血为治疗大法。方中用茵陈、黄芩、大黄清热泻火、利湿退黄为主药，益母草、白芍、木香调合气血，使气机畅达、血脉调合为辅佐之药。

药理研究及临床应用证明，茵陈、黄芩等含有A(B)血型物质，可在胎儿体内与红细胞竞争抗体，降低A(B)抗体对A(B)红细胞的凝聚力，从而保护胎儿[3]。茵陈、黄芩、大黄、益母草、大黄均具有免疫抑制作用，对降低孕妇血清血型抗体效价有良好作用。对预防和治疗胎儿和新生儿溶血症及新生儿核黄疸有较好的疗效。

[1]苗明三.现代中药质量控制技术[M].北京:人民卫生出版社，2000:869，741.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:282，附录 9，34，36.

[3]王 莉，马金秋，韩秀梅.排石通口服液的制备、质量控制与稳定性考察[J].中国药业，2011，20(9):33.

[4]赵 晨.高效液相色谱法测定四黄泻火片中黄芩苷含量[J].中国药业，2011，20(6):37.

[5]韩金兰，郭敬明.ABO血型不合引起早期流产的中药治疗[J].中国中西医结合杂志，1993，13(1):13.