反相高效液相色谱法测定抑毒调肝合剂中丹参素钠含量＊

罗宏丽，冯碧敏，肖顺林

抑毒调肝合剂是由丹参、黄精、党参、贯仲、虎杖5味中药经水煮醇沉制成的中药复方制剂，服用方便，具有补气、解毒、调肝、健脾的作用，临床用于治疗症见疲乏无力、不思饮食、肝区隐痛、自汗的慢性肝炎患者。方中丹参为主药，丹参素钠为其主要有效成分之一，该制剂现行质量标准无含量测定项。为了更好地控制制剂的内在质量，笔者采用反相高效液相色谱(RP－HPLC)法测定了抑毒调肝合剂中丹参素钠的含量，现报道如下。

1 仪器与试药

Dionex Ultimate 3000型高效液相色谱仪(美国戴安公司);Kromasystem 2000色谱工作站(Bio.Tek Instrument Snl公司);Hamiltn ASO－0023型液相色谱进样器;AE240型电子天平(瑞士Mettler公司);AS10200型超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。丹参素钠对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110855－200809);抑毒调肝合剂(泸州医学院附属医院自制，批号为101004，101027，101105);甲醇为色谱纯，水为滤过的蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Hypersil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5μm);流动相:乙腈 － 甲醇 －水 －冰醋酸(0.5∶8∶92∶1);流速:1.0 mL/min;检测波长:280 nm;柱温:30℃;进样量20μL。理论塔板数以丹参素钠计算不低于2 000。在此条件下，丹参素钠色谱峰与相邻干扰峰完全分离(见图1)。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

称取丹参素钠对照品8.13 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为0.813 g/L的丹参素钠对照品溶液。精密量取抑毒调肝合剂100μL，置10 mL离心管，吹干，精密加入甲醇100μL，振荡，离心，即得供试品溶液。取不含丹参的方中各药料，按抑毒调肝合剂生产工艺制备丹参素钠阴性对照样品，取适量，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察:精密吸取丹参素钠对照品溶液2，4，6，8，10 mL，分别置50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成质量浓度依次为 32.52，65.04，97.56，130.08，162.60 μg/mL 的系列标准曲线溶液，摇匀，按上述色谱条件分别进样20μL，测定峰面积。以峰面积(A)为纵坐标、标准曲线溶液质量浓度(C)为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程 A=0.261 1C+1.816，r=0.991 4(n=5)。结果表明，丹参素钠质量浓度在 32.52～162.60μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:精密吸取同一质量浓度的对照品溶液(97.56μg/mL)20μL，按上述色谱条件重复进样6次，记录色谱图。结果的 RSD为0.97%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，在室温条件下分别于0，2，4，6，8，10，12 h 时进样 20 μL，记录峰面积。结果的 RSD 为1.43%(n=7)，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

重复性试验:取同一批(批号为101004)样品适量，共6份，依法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样，记录峰面积。结果丹参素钠的平均含量为 91.63 μg/mL，RSD 为 1.12%(n=6)，表明方法重复性良好。

加样回收试验:精密量取已知含量的样品适量，置试管中，再分别精密加入低、中、高不同质量浓度的丹参素钠对照品溶液，按供试品溶液制备方法制备溶液并依法进样测定，计算加样回收率。结果见表1。

表1 丹参素钠加样回收试验结果(n=9)

2.4 样品含量测定

取样品3支，混匀，精密量取，依法制备供试品溶液，按拟订的色谱条件测定含量。结果批号为101004，101027，101105的样品中丹参素钠含量分别为 91.62，91.59，91.63 μg/mL(n=3)。

3 讨论

丹参是唇形科植物丹参的干燥根茎，为2010年版《中国药典(一部)》收载的常用中药之一，味苦，性微寒，入心、肝经，具有活血化瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈之功，为方中主药。其化学成分分为脂溶性成分和水溶性成分，其中水溶性部分丹参素钠已被证实具有明显抑制肝癌细胞生长、阻止肝细胞硫代乙酰胺损伤和促进肝细胞增生等作用[1－2]。因此本研究中将丹参素钠作为抑毒调肝合剂含量测定的指标性成分之一。

取丹参素钠对照品溶液，在200～400 nm波长范围进行紫外扫描，发现在280 nm波长处有最大吸收，故选其为检测波长。在试验过程中，比较了不同体系和不同比例的流动相对主峰的保留时间、峰形和分离度的影响，结果以乙腈－甲醇－水－冰醋酸(0.5∶8∶92∶1)的分离效果最好，故选其作为流动相。还发现柱温对丹参素钠分离测定影响较大，25℃时主峰的保留时间过长，柱温过高其分离度不好，当柱温选择30℃时结果满意[3－4]。

采用反相高效液相色谱法测定制剂中丹参素钠含量，方法学考察结果表明，方法精密度、稳定性、加样回收率和重复性均能满足定量的要求。故该方法可用于抑毒调肝合剂的质量控制，建议其质量标准升级时增加丹参素钠的含量测定。

[1]吴映雅，谭宇蕙，宁异真，等.丹参素钠对大鼠肝癌细胞及自杀基因旁观者效应的影响[J].中药药理与临床，2007，23(5):52－54.

[2]李跃华，李 菁，戚晓红，等.丹参素和肝细胞生长因子对药物性肝细胞损伤的影响[J].中西医结合肝病杂志，1998，8(3):153－155.

[3]王 梅，杨 华.HPLC法测定防瘫丸中丹参素钠的含量[J].中医研究，2010，23(8):21－23.

[4]黄兰芷，付超美，胡慧玲，等.HPLC法测定抗癌颗粒中丹参素钠的含量[J].成都中医药大学学报，2006，29(2):53－55.