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固相萃取-高效液相色谱法测定葛根中葛根素含量

2012-06-27蒲艳春吴方评杨宏健

中国药业 2012年11期
关键词:小柱葛根素葛根

蒲艳春,吴方评,杨宏健

葛根为豆科植物野葛 Pueraria loata(Willd.)Ohwi的干燥根,习称野葛,在湖南西部、贵州等地分布极其广泛,用于外感发热、头痛等症。现代研究证实,葛根中的主要有效成分为葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类化合物,具有抗炎解热、扩张冠状动脉、增加冠状动脉血流量的作用,同时也有降低血压的作用[1]。有关葛根素的测定研究已有不少的报道。2010年版《中国药典(一部)》采用高效液相色谱法对葛根素含量进行测定[2],但在具体操作过程中葛根素与其他物质吸收峰分离较差。本试验中通过固相萃取小柱预富集,30%的甲醇10 mL洗脱去杂,再用无水乙醇5 mL对固相萃取小柱进行洗脱,用高效液相色谱法对葛根素进行测定,方法的分离度和重现性较好,特别是用C18固相萃取小柱对样品进行富集和除杂尚属首次。该方法可用于葛根中葛根素的分离测定,现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪,包括单泵、可变波长检测器、Agilent汉化版色谱工作站、7725i手动进样阀;SK2200H型超声清洗仪(上海科导超声仪器有限公司);FA1004型电子分析天平(上海精密科学仪器厂);Sep-Park-C18固相萃取小柱(Waters公司),Unic4802型紫外-可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)。葛根素(中国药品生物制品检定所,批号为110752-200912,供含量测定用);葛根购于湖南怀化怀仁大药房,采收于2009年11月;水为2次蒸馏水;甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)为色谱纯,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

精确称取葛根素对照品0.005 0 g,用5 mL的甲醇溶解,再用2次重蒸水定容至50 mL,即得0.100 0 g/L的葛根素对照品溶液。取少量葛根粉,过三号筛,精密称取0.10 g,置具塞锥形瓶中,加入30%的乙醇水溶液50 mL,超声提取30 min,过滤,提取液水浴蒸至无醇味,加入5 mL甲醇,振摇,转入50 mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度;取25 mL样品溶液,以5 mL/min的流速过预处理的Sep-Park-C18固相萃取小柱,先用30%的甲醇溶液10 mL洗脱除杂,再用5 mL无水乙醇以1 mL/min的流速洗脱,弃去最初的1 mL;水浴挥去乙醇,用流动相溶解并定容至5 mL,作为供试品溶液。

2.2 色谱条件与试验适用性试验

色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm);流动相:甲醇-水(25∶75);流速:0.5 mL/min;检测波长:251 nm;进样量:20μL。在上述条件下的色谱图见图1。可见,葛根素的保留时间为2.910 min,且分离度较好。

图1 高效液相色谱图

2.3 方法学考察

线性关系考察:分别精密量取 0.1,0.1,0.2,0.4,0.8 mL 质量浓度为0.100 0 g/L的葛根素对照品溶液,用2次蒸馏水分别定容至 100,50,50,50,50 mL,分别得质量浓度为 0.1,0.2,0.4,0.8,1.6 μg/mL 的系列溶液,过 C18固相萃取小柱,乙醇洗脱,挥去乙醇,用流动相分别定容至 10,5,5,5,5 mL,依法进样。以对照品峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线,回归方程为 A=3 987.28C -32.14,r=0.999 3(n=5)。结果表明,葛根中葛根素用C18固相萃取小柱富集后含量在0.1~1.6μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密度试验:取质量浓度为1.6μg/mL的对照品溶液25 mL,用C18固相萃取小柱富集至5 mL,依法重复进样5次。结果峰面积的 RSD为0.93%。

重复性试验:取同一批样品粉末5份,每份0.2 g,依法制备供试品溶液并进样测定。结果含量的 RSD为0.97%。

稳定性试验:取同一供试品溶液,分别于 0,1,2,3,4,6,8 h时依法进样。结果葛根素含量的 RSD为0.79%。

加样回收试验:精确称取6批已知含量的葛根粉末0.01 g,每两份为1组,分别加入葛根素对照品适量,按供试品溶液制备方法处理,依法测定含量,计算回收率。结果见表1。

表1 葛根素加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

精确称取不同批次的样品各5份,按供试品溶液制备方法进行样品处理,并按2.2项下条件进样,用外标法计算葛根中葛根素的含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=5)

3 讨论

葛根素的提取可用加热回流、微波辅助提取和超声提取等方法,考虑到提取效率和提取率,本试验采用了超声提取法,并试验了不同的提取时间,结果在150 W功率下,超声提取30 min可基本把葛根素提取完全。

由于乙醇对C18固相萃取材料的洗脱强度较大,葛根素在C18固相萃取小柱上不能保留,因此本试验通过除去乙醇,再改用低浓度甲醇溶液对样品进行溶解,保证葛根素在C18固相萃取小柱上能充分地得到保留。洗脱除杂时试验了不同浓度的甲醇对葛根素的洗脱情况,当甲醇浓度低于30%时,葛根素在固相萃取小柱上能较好保留,故用30%的甲醇对固相萃取小柱进行洗脱除去大部分的干扰杂质,再用5 mL无水乙醇对葛根素进行洗脱。

[1]章育中,杨 凡.高效液相色谱法测定葛根及其片剂中异黄酮的含量[J].药物分析杂志,1984,4(2):67.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:312.

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