固相萃取-高效液相色谱法测定葛根中葛根素含量

蒲艳春，吴方评，杨宏健

葛根为豆科植物野葛 Pueraria loata(Willd.)Ohwi的干燥根，习称野葛，在湖南西部、贵州等地分布极其广泛，用于外感发热、头痛等症。现代研究证实，葛根中的主要有效成分为葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类化合物，具有抗炎解热、扩张冠状动脉、增加冠状动脉血流量的作用，同时也有降低血压的作用[1]。有关葛根素的测定研究已有不少的报道。2010年版《中国药典(一部)》采用高效液相色谱法对葛根素含量进行测定[2]，但在具体操作过程中葛根素与其他物质吸收峰分离较差。本试验中通过固相萃取小柱预富集，30%的甲醇10 mL洗脱去杂，再用无水乙醇5 mL对固相萃取小柱进行洗脱，用高效液相色谱法对葛根素进行测定，方法的分离度和重现性较好，特别是用C18固相萃取小柱对样品进行富集和除杂尚属首次。该方法可用于葛根中葛根素的分离测定，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪，包括单泵、可变波长检测器、Agilent汉化版色谱工作站、7725i手动进样阀;SK2200H型超声清洗仪(上海科导超声仪器有限公司);FA1004型电子分析天平(上海精密科学仪器厂);Sep－Park－C18固相萃取小柱(Waters公司)，Unic4802型紫外－可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)。葛根素(中国药品生物制品检定所，批号为110752－200912，供含量测定用);葛根购于湖南怀化怀仁大药房，采收于2009年11月;水为2次蒸馏水;甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

精确称取葛根素对照品0.005 0 g，用5 mL的甲醇溶解，再用2次重蒸水定容至50 mL，即得0.100 0 g/L的葛根素对照品溶液。取少量葛根粉，过三号筛，精密称取0.10 g，置具塞锥形瓶中，加入30%的乙醇水溶液50 mL，超声提取30 min，过滤，提取液水浴蒸至无醇味，加入5 mL甲醇，振摇，转入50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度;取25 mL样品溶液，以5 mL/min的流速过预处理的Sep－Park－C18固相萃取小柱，先用30%的甲醇溶液10 mL洗脱除杂，再用5 mL无水乙醇以1 mL/min的流速洗脱，弃去最初的1 mL;水浴挥去乙醇，用流动相溶解并定容至5 mL，作为供试品溶液。

2.2 色谱条件与试验适用性试验

色谱柱:Agilent Eclipse XDB－C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm);流动相:甲醇－水(25∶75);流速:0.5 mL/min;检测波长:251 nm;进样量:20μL。在上述条件下的色谱图见图1。可见，葛根素的保留时间为2.910 min，且分离度较好。

图1 高效液相色谱图

2.3 方法学考察

线性关系考察:分别精密量取 0.1，0.1，0.2，0.4，0.8 mL 质量浓度为0.100 0 g/L的葛根素对照品溶液，用2次蒸馏水分别定容至 100，50，50，50，50 mL，分别得质量浓度为 0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 μg/mL 的系列溶液，过 C18固相萃取小柱，乙醇洗脱，挥去乙醇，用流动相分别定容至 10，5，5，5，5 mL，依法进样。以对照品峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线，回归方程为 A=3 987.28C －32.14，r=0.999 3(n=5)。结果表明，葛根中葛根素用C18固相萃取小柱富集后含量在0.1～1.6μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密度试验:取质量浓度为1.6μg/mL的对照品溶液25 mL，用C18固相萃取小柱富集至5 mL，依法重复进样5次。结果峰面积的 RSD为0.93%。

重复性试验:取同一批样品粉末5份，每份0.2 g，依法制备供试品溶液并进样测定。结果含量的 RSD为0.97%。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别于 0，1，2，3，4，6，8 h时依法进样。结果葛根素含量的 RSD为0.79%。

加样回收试验:精确称取6批已知含量的葛根粉末0.01 g，每两份为1组，分别加入葛根素对照品适量，按供试品溶液制备方法处理，依法测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 葛根素加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

精确称取不同批次的样品各5份，按供试品溶液制备方法进行样品处理，并按2.2项下条件进样，用外标法计算葛根中葛根素的含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=5)

3 讨论

葛根素的提取可用加热回流、微波辅助提取和超声提取等方法，考虑到提取效率和提取率，本试验采用了超声提取法，并试验了不同的提取时间，结果在150 W功率下，超声提取30 min可基本把葛根素提取完全。

由于乙醇对C18固相萃取材料的洗脱强度较大，葛根素在C18固相萃取小柱上不能保留，因此本试验通过除去乙醇，再改用低浓度甲醇溶液对样品进行溶解，保证葛根素在C18固相萃取小柱上能充分地得到保留。洗脱除杂时试验了不同浓度的甲醇对葛根素的洗脱情况，当甲醇浓度低于30%时，葛根素在固相萃取小柱上能较好保留，故用30%的甲醇对固相萃取小柱进行洗脱除去大部分的干扰杂质，再用5 mL无水乙醇对葛根素进行洗脱。

[1]章育中，杨 凡.高效液相色谱法测定葛根及其片剂中异黄酮的含量[J].药物分析杂志，1984，4(2):67.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:312.