河南汉族动脉硬化性脑梗死人群血小板膜糖蛋白HPA-2基因多态性检测*

尚迎辉，李 涛，白峻瑜，石聪聪，封青川，贺 颖，郑 红#

1)郑州市市直机关医院内科郑州450007 2)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室郑州450001

血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)Ib-Ⅸ复合物(GPIb-Ⅸ-Ⅴ)是血小板膜上主要的糖蛋白之一，由2分子GPIba亚单位、2分子 GPIb亚单位、2分子GPⅨ和1分子 GPⅤ组成。GPIba是 GPIb-Ⅸ-Ⅴ复合物中最大的多肽，含有凝血酶高亲和力结合位点，可在低凝血酶浓度时激活血小板，进而参与动脉粥样硬化的发生、血栓栓塞的形成和血管痉挛等［1-2］。GPIba基因位于17号染色体短臂，具有高度多态性。编码GPIba的基因序列的C/T多态性(ACG/ATG)导致位于vWF受体结合区的GPIba链第145残基的Thr/Met(苏氨酸/蛋氨酸)二态性，该区域富含亮氨酸，是人类血小板同种异体抗原2(HPA-2)分类的基础，在145位苏氨酸和蛋氨酸分别对应HPA-2a和HPA-2b［3-4］。该多态位点位于vWF受体结合区，可增强血小板的黏附作用，可能是脑卒中发病的遗传危险因素［5-6］。作者应用PCR-RFLP方法对河南汉族436例动脉硬化性脑梗死(atherothrombotic brain infarction，ABI)患者进行GPIba HPA-2基因多态性检测，探讨该多态性与ABI的关系，为ABI的防治提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2004年12月至2006年6月河南省二甲以上医院神经内科住院的ABI患者436例，经临床检查(病史、体征、生化检验、CT或MRI)确诊，ABI的诊断参照第四届脑血管会议修订的诊断标准。患者中男280例，女156例，年龄(62.2±12.2)岁。正常对照选自同期健康体检者549例，其中男313 例，女236例，年龄(62.6 ±12.2)岁。研究个体之间无血缘关系，均为河南汉族人群。排除患有心、脑血管疾病及肝、肾、内分泌疾病者，所有患者均知情同意。

1.2 GPIba HPA-2基因多态性检测 抽取研究对象清晨空腹外周静脉血3 mL，EDTA抗凝，用常规酚/氯仿法提取基因组DNA，以此为模板，进行PCR扩增。PCR扩增引物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物序列5’-GGACGTCTCCTTCAACCGGC-3’，下 游 引 物 序 列 5’-GCTTTGGTGGGGAACTTGAC-3’，产物大小591 bp。PCR扩增体系:模板 DNA 2 μL，上、下游引物各 2 μL，2 × Taq PCR Master Mix 6 μL，去离子水补至25 μL。PCR 扩增条件:94℃预变性4 min;94℃变性1 min，63℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环30次;72℃延伸7 min。取PCR产物进行AcyI酶切反应，取8 μL酶切产物于20 g/L琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像分析系统观察电泳结果。

1.3 统计学处理 运用SPSS 16.0进行统计分析，对2组之间的基因型频率及等位基因频率的差异进行χ2检验，并计算比数比(OR)及95%可信区间(CI)，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1GPIba HPA-2基因多态性PCR-RFLP分型结果 见图1。GPIba基因HPA-2多态位点PCR产物经AcyⅠ酶切后，可有3个型别，产生270、201和120 bp 3个片段为a/a型;产生390、201 bp 2个片段为b/b型，产生120、201、270和390 bp 4个片段为a/b型。

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 对照组基因型频率的分布符合Hardy-weinberg平衡(χ2=0.019，P=0.650)，说明该样本具有良好的人群代表性。

2.3 2组GPIba HPA-2基因型和等位基因频率的比较 见表1。可以看出，ABI组和对照组HPA-2基因型和等位基因频率差异无统计学意义。

表1 2组GPIba HPA-2基因型及等位基因频率的比较 例(%)

2.4 河南汉族人群GPIba HPA-2基因型频率与其他人群的比较 见表2。可以看出，GPIba HPA-2多态性存在显著的地域和种族差异。

表2 河南汉族人群GPIba HPA-2基因型频率与其他人群的比较

3 讨论

GPIb是血小板膜上含量最多的糖蛋白，每个血小板上有将近25 000个GPIb分子，是参与构成血小板的主要黏附受体，在血栓形成中起重要作用［2］。

张彤等［12］对100例心肌梗死患者和104例无心脏病史的正常对照进行GPIba基因多态性检测发现，HPA-2 a/b+b/b型的频率与德国人和日本人报道的相似，并得出145Met等位基因(HPA-2b)与心肌梗死的发生显著相关的结论(OR=2.2)，表明HPA-2b等位基因是心肌梗死发生的一个独立危险因素。该研究结果证实，河南汉族人群中GPIba HPA-2存在3种基因型，而ABI与正常河南汉族人群中3种基因型和2个等位基因的频率差异并无统计学意义，与张涌等［7］在脑血栓人群中的结果一致。该研究中b等位基因的频率很低，HPA-2 b/b纯合子仅在对照组中发现1例，推测与研究样本量少有关，又或者这本身体现了中国北方汉族人群GPIba HPA-2多态性的特点，因此仍需扩大样本量进行深入研究。

该研究结果还显示，河南汉族人群HPA-2各基因型频率分别为 89.6%(a/a)、0.2%(b/b)和10.2%(a/b)，与济南地区人群中的频率比较差异无统计学意义，表明近距离地理范围内汉族人群HPA-2各基因型频率趋于一致;与同属亚洲地区的印度人群相比，河南汉族人群HPA-2 a/a基因型频率稍高，推测这种差异也可能与研究的样本量较小有关;与高加索、美国白人和非洲人群比较，河南汉族人群HPA-2基因型频率较高，a/b和b/b型频率稍低，提示HPA-2多态性存在显著的地域和种族差异，因此关于该多态性国内外结论各异的报道，尚需要扩大样本进一步研究验证。

最近研究［13］表明GPIba的VNTR多态性可能与河南汉族人群ABI的发生有关;而HPA-2多态性与VNTR多态性之间存在连锁不平衡，HPA-2a与VNTR的D和C多态连锁，而HPA-2b则与B和A多态连锁［9，14］。因此，对 HPA-2 与 VNTR 两种多态性进行单体型分析，深入探讨GPIba基因多态性及单体型与ABI的相关性，将有助于对ABI发病分子遗传机制的认识。

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