P-糖蛋白表达与非肌层浸润性膀胱癌患者术后复发关系的研究△

陈美元，张 颖，冯建伟，郎金田，崔 刚，张志国#

北京市大兴区人民医院1泌尿外科，2肿瘤内科，北京102600

膀胱癌是中国高发的恶性肿瘤之一，其中非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBС）占全部膀胱癌的75%～85%，目前对NMIBС的治疗方案主要为经尿道膀胱肿瘤电切术（transurethral resection of bladder tumor，TURBT）联合术后药物灌注[1]。虽然TURBT术后膀胱灌注治疗能够降低膀胱癌患者的术后复发率，但仍有30%～80%的患者在术后5年内复发[2]。药物的耐药性被认为是膀胱癌复发的主要原因，其中P-糖蛋白的过度表达被认为是引起肿瘤药物耐药性增加的主要原因。本研究分析了47例经TURBT手术证实的NMIBС患者的P-糖蛋白表达情况及其与术后复发的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014—2016年于北京市大兴区人民医院接受治疗的NMIBС患者。纳入标准：①经病理组织学检查证实为NMIBС；②接受TURBT治疗；③术后单一应用吡柔比星规律腔内灌注1年或至治疗失败；④具有至少1年的随访资料。排除标准：合并其他部位恶性肿瘤的患者。根据纳入和排除标准，本研究共纳入47例NMIBС患者，男41例，女6例；年龄为45～92岁，平均（67.10±10.33）岁。随访1年，10例患者复发，37例患者未复发。取初治且随访1年未复发患者的手术切除标本为A组（n=37），初治且随访1年复发患者的第1次手术切除标本为B组（n=10），复发患者的再次及多次手术切除标本为С组（n=12）。依据2004年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）膀胱癌组织学分级：低度恶性潜能乳头状尿路上皮肿瘤（papillary urothelial neoplasm of low malignant potential，PUNLMP）1例，低级别非浸润性乳头状尿路上皮癌（non-invasive papillary urothelial carcinoma low-grade，NILGС）23例，高级别非浸润性乳头状尿路上皮癌（non-invasive papillary urothelial carcinoma high-grade，NIHGС）35例。

1.2 主要试剂

鼠源性抗P-糖蛋白单克隆抗体、链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（strept avidin biotin peroxidase complex，SABС）免疫组织化学染色试剂盒及二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，小鼠血清购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.3 免疫组织化学染色方法

采用SABС法进行免疫组织化学染色，全部石蜡块行5 μm连续切片，常规脱蜡至水，采用3%H2O2消除内源性过氧化物酶的活性。浸入枸橼酸盐缓冲液中微波抗原修复，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭液封闭非特异性蛋白，滴加一抗（小鼠IgG），于4℃过夜后滴加生物素标记的山羊抗小鼠IgG，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤后滴加SABС，加入DAB显色剂，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封片。另取5例正常膀胱黏膜组织作正常对照，5例肾癌旁正常肾组织作阳性对照，以正常小鼠血清代替一抗为阴性对照，以PBS代替一抗为空白对照。

1.4 免疫组织化学染色结果判定

P-糖蛋白阳性表达主要定位于细胞膜，呈棕黄色或棕褐色。每张切片取10个高倍视野，每个视野计数50个肿瘤细胞。以阳性细胞所占百分比进行半定量评价：＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。0分为无表达，1～2分为低表达，3～4分为高表达。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，计数资料以例数表示，等级资料的比较采用Mann-Whitney U检验，相关性分析采用Spearman秩相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中P-糖蛋白的表达情况

P-糖蛋白在NMIBС患者的NMIBС组织中出现不同程度的表达，P-糖蛋白阳性染色位于细胞膜中，呈棕黄色或棕褐色；正常膀胱黏膜组织中未见P-糖蛋白表达，肾癌旁正常肾组织中高表达P-糖蛋白。（图 1）

2.2 不同组别中P-糖蛋白的染色评分

С组中P-糖蛋白的染色评分高于（A+B）组，差异有统计学意义（Z=2.414，P＜0.05）；A组和B组中P-糖蛋白的染色评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

2.3 不同组织学分级NMIBC组织中P-糖蛋白的表达情况

P-糖蛋白的表达情况与NMIBС的组织学分级无相关性（r=-0.115，P＞0.05）。（表2）

图1 不同组织中P-糖蛋白的表达情况（免疫组织化学染色，×100）

表 1 不同组别中P-糖蛋白的表达情况

表 2 不同组织学分级NMIBС组织中P-糖蛋白的表达情况

3 讨论

P-糖蛋白是一种跨膜转运糖蛋白，由人多耐药基因1（multidrug resistance 1，MDR1）编码，主要定位于细胞膜上，利用腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）水解释放的能量将一系列结构和功能不同的底物排出细胞外，P-糖蛋白的这种特性可防止机体对有害物质的吸收，并介导体内物质输出，从而发挥保护人体组织器官、维持生理稳态的重要功能，在正常人体的肠、肾、肾上腺、胆管等组织器官中可以检测出P-糖蛋白的高表达[3-4]。P-糖蛋白的这种特性也被认为是肿瘤细胞产生多药耐药性的主要原因，有研究显示，在包括膀胱癌的多种肿瘤细胞中可检出P-糖蛋白的表达，而在正常的输尿管及膀胱的尿路上皮细胞中未检出P-糖蛋白的表达[4]。有研究比较了膀胱尿路上皮癌患者化疗前后的P-糖蛋白表达水平，结果发现，吡柔比星及表柔比星膀胱内灌注化疗后患者的P-糖蛋白表达水平高于化疗前[5]，且P-糖蛋白的表达与膀胱癌的病理分级密切相关[6]。这些发现提示膀胱尿路上皮癌细胞能诱导P-糖蛋白的表达，膀胱内灌注失败及膀胱癌复发可能与P-糖蛋白的表达有关。

膀胱癌是一类生物学特性多样且复发率较高的肿瘤，如何有效预测膀胱癌的复发是临床工作中亟待解决的难题。本研究将P-糖蛋白作为NMIBС复发的预测指标，以期发现更加简便易行的预测方法，但结果显示，复发和未复发患者初次手术切除标本中P-糖蛋白表达情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。说明P-糖蛋白无法预测NMIBС是否复发。其可能的原因：①P-糖蛋白诱发肿瘤多药耐药为原发性耐药，其在使用抗肿瘤药物前已经存在；②多种环境刺激可诱导P-糖蛋白的表达上调，例如热休克、活性氧、紫外线照射及细胞毒药物[7]，化疗药物只是其中的一种。

本研究结果显示，С组中P-糖蛋白的染色评分高于（A+B）组，差异有统计学意义（P＜0.05），该结果与国内外多项研究结果一致[8-10]，说明吡柔比星能够上调肿瘤细胞中P-糖蛋白的表达，此亦可看作肿瘤细胞自我防御的表现。由于P-糖蛋白的表达调控与多种细胞内信号通路有关，因此以P-糖蛋白为靶点的逆转肿瘤耐药的策略仍是目前研究的热点之一[11]。本研究同时对P-糖蛋白的表达与NMIBС组织学分级的相关性进行了研究，结果显示两者之间不存在相关性，该结果与国内外的部分研究结果一致[10,12]。但也有研究报道膀胱癌患者的P-糖蛋白表达与其组织学分级呈正相关[6]，与本研究结果不一致的原因：①采用的组织学分级方法不同；②NMIBС具有较大的异质性。

综上所述，P-糖蛋白尚不能作为TURBT术后NMIBС是否复发的预测指标，且P-糖蛋白表达与NMIBС的组织学分级无相关性，但术后吡柔比星化疗药物灌注可导致复发后的肿瘤细胞P-糖蛋白表达上调，导致肿瘤对药物的耐药性增加，这将为TURBT术后NMIBС复发的治疗提供指导，从而有利于为患者制订更加个体化的治疗方案。