肺癌组织热休克蛋白70提取物对A549细胞增殖的影响*

孙鹏辉，梁守沛，陆皓泉，李 杰，王小龙，许 东，姚 武，吴逸明，周 舫

郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室郑州450001

肺癌是当今世界上流行最广、危害最严重的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均呈现逐年上升趋势，已成为绝大多数国家癌症死亡的首要病因，严重威胁着人类的身体健康。研究［1-2］表明，热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)在胃癌、结肠癌等多种肿瘤组织中均可高表达，在肿瘤的发生发展、治疗和预后过程中起着重要作用。另有研究［3］显示，HSP70在肺癌细胞和组织中均呈现高表达，并与肺癌的生长和转移有密切关系。作者从肺癌组织提取HSP70多肽复合物，分别以不同浓度、不同时间刺激肺腺癌A549细胞，观察HSP70多肽复合物对肺癌细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 经患者知情同意并签署知情同意书后，实验组织标本取自郑州大学第一附属医院1例肺腺癌患者行手术切除的肺腺癌组织。RPMI 1640培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，MTT(Sigma公司)，ConA-Sepharose 4B亲和层析凝胶(GE Healthcare公司)，鼠抗人HSP70单克隆抗体(北京博奥森生物科技有限公司)，辣根酶标记羊抗鼠IgG抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，ECL化学发光试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)，快速蛋白液相色谱纯化系统(GE Healthcare公司)，JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机(上海新芝生物技术研究所)。

1.2 肺组织HSP70多肽复合物的提取与纯化 将收集到的肺癌组织研磨、裂解后收集组织总蛋白，进行ConA-Sepharose 4B亲和层析后，收集透析袋内液体冻干浓缩，进行DEAE离子交换层析，收集每个波峰产生的样品进行进一步的交换层析，将所得的样品进行真空冻干浓缩，增大样品蛋白单位体积的浓度，然后采用 Western blot法进行鉴定。

1.3 不同浓度HSP70多肽复合物作用不同时间对A549细胞增殖的影响 复苏A549细胞(中科院上海细胞生物研究所提供)用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，细胞融合至90%时用2.5 g/L的胰蛋白酶消化，用含血清的培养基重悬细胞进行传代，细胞传2代后可用于实验。取对数生长期的A549细胞消化后制成细胞悬液，调整细胞浓度为2.5 ×107L－1，以每孔 200 μL 接种于 96孔板(空白组只加入培养液)，培养24 h待细胞贴壁稳定后，吸弃原液，实验组分别加入含 0.1、0.5、1.0、2.5 及 5.0 mg/L 的 HSP70 多肽复合物的培养液，空白组及对照组只加入培养液继续培养，每组设6个复孔，分别在24、48和72 h后将细胞取出，每孔中加入5 g/L的MTT染液20 μL，放入培养箱中继续培养3 h，弃去培养基，每孔加入DMSO 100 μL，放入摇床中室温震荡10 min，酶联免疫检测仪检测各组在492 nm处的吸光度值。

1.4 统计学处理 运用SPSS 12.0处理数据，采用3×6析因设计的方差分析观察HSP70多肽复合物浓度及作用时间对A549细胞增殖的影响，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1HSP70多肽复合物的提取、纯化结果 经ConASepharose 4B亲和层析后与层析介质不结合的蛋白为非糖蛋白，将收集到的非糖蛋白经DEAE交换层析，对每个波峰进行再次层析、Western blot鉴定后确定最终分离的蛋白即为HSP70多肽复合物。见图1。

图1 分离纯化样品后蛋白的SDS-PAGE电泳图

2.2 不同浓度HSP70多肽复合物作用不同时间对A549细胞增殖的影响 结果见表1。

表1 不同浓度HSP70多肽复合物作用不同时间对A549细胞增殖的影响(n=6)

3 讨论

热休克蛋白(HSPs)又称热应激蛋白，是生物体内普遍存在、进化上高度保守的一类蛋白。HSPs可以充当细胞内的分子伴侣，调节细胞凋亡通路，保护细胞免受各种应激刺激或其他病理生理刺激所致的死亡威胁。哺乳类动物HSPs按其相对分子质量可以分为 HSP90、HSP70、HSP60 和小分子 HSPs等［4］。

在非应激状态下，生物体内的HSP70不表达或低表达，但是一旦遭受诸如高温、氧化应激和抗癌药物等多种急性或慢性的物理性或化学性应激因素的刺激均可导致其过表达以保护细胞免于各种致死性应激因素所造成的损害。HSP70在细胞内不仅作为分子伴侣发挥作用，还扮演着管家分子的重要角色。正常情况下，各种细胞应激均可诱导HSP70表达，但是肿瘤组织中高表达的HSP70却担负着抗凋亡蛋白的作用，这种作用可能与肿瘤的发生密切相关。HSP70的抗凋亡作用可能是通过抑制凋亡信号转导通路来实现的，如HSP70能抑制细胞内应激酶JNK的激活［5-6］。该实验结果显示，HSP70可促进肺腺癌A549细胞增殖，在浓度一定时，随着HSP70复合物作用时间的延长，这种增殖效应呈现逐渐增强的趋势。这就说明，在一定浓度条件下HSP70对A549细胞可能具有保护作用，并能够促进A549细胞的增殖。作者还发现在相同的作用时间里，复合物浓度的增加对细胞活性也有积极的影响。造成这种现象的原因很可能是肿瘤的形成和发展过程是以恶变细胞的恶性增殖为特点的，在这一异常的增殖过程中，肿瘤细胞内的内环境失衡，合成代谢能力增强，抑制代谢的能力受到抑制，整个过程需要大量的HSP70来调节和稳定这一异常增殖过程。Jaattela等［7］发现在啮齿类动物模型中HSP70可以增加癌细胞的致瘤性，同时HSP70的下调可致癌细胞死亡。大量研究［8-9］证实HSP70在调控细胞周期和细胞生长方面发挥着重要的作用。这些都说明了HSP70在肿瘤发生发展中的重要作用。HSP70复合物对A549细胞的增殖作用是通过各种因素共同实现的，其具体的作用机制还需要进一步的研究探讨。

［1］Liu W，Chen Y，Lu G，et al.Down-regulation of HSP70 sensitizes gastric epithelial cells to apoptosis and growth retardation triggered by H.pylori［J］.BMC Gastroenterol，2011，11:146

［2］Bauer K，Nitsche U，Slotta-Huspenina J，et al.High HSP27 and HSP70 expression levels are independent adverse prognostic factors in primary resected colon cancer［J］.Cell Oncol，2012，35(3):197

［3］Wang H，Xing J，Wang F，et al.Expression of Hsp27 and Hsp70 in lymphocytes and plasma in healthy workers and coal miners with lung cancer［J］.J Huazhong Univ Sci Technol:Med Sci，2010，30(4):415

［4］Park HS，Jeong WJ，Kim E，et al.Heat shock protein gene family of the porphyra seriata and enhancement of heat stress tolerance by PsHSP70 in chlamydomonas［J］.Mar Biotechnol，2012，14(3):332

［5］刘新奎，王琳，张明智.热化疗对 Raji细胞生长、JNK通路及热休克蛋白70表达的影响［J］.郑州大学学报:医学版，2010，45(3):372

［6］Padmini E，Venkatraman U，Srinivasan L.Mechanism of JNK signal regulation by placental HSP70 and HSP90 in endothelial cell during preeclampsia［J］.Toxicol Mech Methods，2012，22(5):367

［7］Jaattela M.Over-expression of hsp70 confers tumorigenicity to mouse fibrosarcoma cells［J］.Int Cancer，1995，60(5):689

［8］Nagao J，Cho T，Uno J，et al.Candida albicans Msi3p，a homolog of the Saccharomyces cerevisiae Sse1p of the Hsp70 family，is involved in cell growth and fluconazole tolerance［J］.FEMS Yeast Res，2012，12(6):728

［9］Raina P，Kaur S.Knockdown of LdMC1 and Hsp70 by antisense oligonucleotides causes cell-cycle defects and programmed cell death in Leishmania donovani［J］.Mol Cell Biochem，2011，359(1/2):135