结核分枝杆菌CFP21抗原的HLA-A*0201/*03限制性细胞毒T淋巴细胞表位预测*

翟文杰，翟明霞，吕 虹，祁元明，高艳锋

郑州大学生物工程系郑州450001

结核病是由结核杆菌引起的一种慢性传染病，目前仍然是发病率和病死率较高的一种传染病。近年来，结核杆菌和人体免疫缺陷病毒双重感染的出现造成个体机会性感染更加严重［1］。传统预防结核病的卡介苗(BCG)免疫效果不稳定，对预防成年人肺结核缺乏有效性，并且随着结核杆菌多重耐药菌株的出现［2］，新型抗结核疫苗的研制变得更加迫切。结核杆菌分泌蛋白CFP21能够诱导结核鼠及结核患者产生高水平的肿瘤坏死因子-γ(tumor necrosis factor-γ，TNF-γ)［3］，具有高度的免疫原性，是结核疫苗设计的候选抗原。因此，寻找CFP21抗原的HLA-I限制细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)表位对开发安全高效的新型结核疫苗具有非常重要的意义。通过作者所在的课题组前期对CFP21抗原的HLA-A*0201限制性CTL表位的研究［4-5］，预测在CFP21抗原中可能存在 HLA-A*03限制性 CTL表位［6］。通过抗原肽修饰改造［7］、结合力分析［8］和细胞毒活性［9］等实验，鉴定结核分枝杆菌CFP21抗原同时针对HLA-A*0201/*03型别的广谱CTL表位，为今后开发适应更广泛人群的结核疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 血液样本与细胞株 HLA-A*03+PPD+健康供者的外周血来自实验室的志愿者。抗原多肽转运蛋白(TAP)缺陷的T2A3细胞由美国纽约血液中心安秀丽教授惠赠。

1.2 主要试剂和实验器材 RPMI 1640培养基(Invitrogen公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)，二甲基亚砜(DMSO，天津市德恩化学试剂有限公司)，重组人 β2微球蛋白(rβ2-M)、丝裂霉素 C、重组鼠抗人rβ2-M单抗及细菌脂多糖(LPS)(Sigma公司)，尼龙毛柱(Wako公司)，FITC-羊抗鼠IgG(北京博奥森生物技术有限公司)，重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rGM-CSF)与白细胞介素-4(rIL-4)(Peprotech公司)，乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒活性检测试剂盒(Promega公司)。反相高效液相色谱仪(岛津公司)，BRUKER Esquire-3000电喷雾-离子阱多级质谱仪(ESI-MS，德国布鲁克道尔顿仪器公司)，流式细胞仪(Becton Dickinson公司)。

1.3 表位预测和多肽合成 CFP21抗原氨基酸全长序列从 NCBI网站获取，共 217个氨基酸，CAA98399.1。采用在线数据库SYFPEITHI初步预测，结合 BIMAS 和 NetCTL 1.2 在线［10］分析，对比HLA-A*0201 的预测结果［4］，针对 HLA-A*03 型别进行CFP21抗原的天然表位预测。选取评分结果较好的表位肽作为母体肽。对母体肽按1Y、2L和(或)9L进行氨基酸置换，获得改造肽，对已经筛选出来的表位，采用标准Fmoc方案合成多肽，产物经RP-HPLC分析、纯化，获得纯度高于95%的九肽产物。经ESI-MS测定，相对分子质量与理论值相符合。阳性肽的合成参照文献［5］。

1.4 T2A3细胞结合力实验 取T2A3细胞(1×109L－1)置于含有 rβ2-M(3 mg/L)的无血清 RPMI 1640培养基中，加入候选肽(50 mg/L)，37℃孵育18 h;然后洗2次，加100 μL按1∶100稀释的一抗(鼠抗人rβ2-M)，4℃ 暗处孵育 30 min后洗3次，加入50 μL按1∶50稀释的FITC-羊抗鼠IgG，4℃反应30 min;收获细胞后上流式细胞仪检测。结果以荧光系数(FI)表示。FI=(表位肽平均荧光强度－背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度。

1.5 细胞毒活性实验 取HLA-A*03+PPD+健康供者的外周血，分离获得外周血单个核细胞(PBMCs)，尼龙毛柱法分离T淋巴细胞，保存备用。PBMCs经rGM-CSF、rIL-4诱导培养，2 d半量换液1次;培养至第5天，加100 μg/L LPS诱导成熟，48 h后收集细胞，即成熟的树突状细胞(DC)。无血清RPMI 1640培养基洗涤成熟DC，重悬后加入候选肽(10 mg/L)和 rβ2-M(3 mg/L)培养4 h;收集细胞，用培养基洗涤3次去除多余的多肽;重悬后加入丝裂霉素C(50 mg/L)，继续培养1 h，用培养基洗涤3次，重悬细胞。以分离的T淋巴细胞作为反应细胞，荷肽的DC作为刺激细胞，按T淋巴细胞每孔1×106个，荷肽的DC每孔1×105个，加入24孔板中，每孔1 mL，继续培养，隔日添加rIL-2(1×105U/L)，每2～3 d半量换液且补足rIL-2;7 d后收集细胞;以同样的方法进行3轮刺激。最后1次刺激后第5天，收集细胞，获得CTL。使用非放射性LDH细胞毒活性检测试剂盒测试细胞毒活性。以荷肽(50 mg/L)的 T2A3作为靶细胞(1×104个/孔)，按照不同效靶比(20∶1和40∶1)加入效应细胞CTL，37℃共培养5 h后进行LDH释放量检测。参照文献［5］计算细胞特异杀伤率。

2 结果

2.1 表位预测结果 经在线数据库预测，获取 4条评分显著高于其他CTL表位的母体肽;对第1、2和9位氨基酸残基进行替换后通过3个数据库的综合预测，获得3条分值较高的改造肽，见表1。

表1 候选表位肽的在线数据库预测结果

2.2 结合力实验和细胞毒活性实验结果 T2A3细胞结合力实验结果显示，母体肽中p134与HLA-A*03分子的结合力较高，FI为0.90;改造肽 p134-1Y2L、p134-1Y2L9L与HLA-A*03分子的结合力也较高，FI分别为1.10和0.70。细胞毒活性实验检测发现，母体肽中p134对靶细胞具有比较明显的杀伤效应，效靶比为20∶1和40∶1时，细胞特异杀伤率分别为12.1%和37.4%。改造肽 p134-1Y2L9L对靶细胞的杀伤效率较低，效靶比为20∶1时，细胞特异杀伤率为12.0%，效靶比为40∶1时仅为24.1%;而 p134-1Y2L并未表现出明显的杀伤作用。

3 讨论

分泌蛋白以及细胞壁蛋白是结核杆菌主要的免疫保护抗原。位于Mtb基因组和BCG差别区(RD区)内的分泌蛋白由于其在BCG中的缺失，逐渐成为疫苗候选抗原的热点。优势抗原表位的鉴定对发展更有效的结核病治疗性多表位肽疫苗具有重要的意义。结核杆菌分泌蛋白CFP21位于RD2区，具有高度的免疫原性。CFP21能够诱导结核感染者产生T淋巴细胞增殖反应以及释放高水平TNF-γ，发挥细胞杀伤作用，是抗结核疫苗设计的理想候选抗原［3，11-12］。

与全蛋白疫苗相比，基于表位的多肽疫苗不仅可以有目的性地选择优势表位，舍弃不利于免疫应答的表位，从而诱导更有效的反应;还能够克服使用整个重组蛋白所涉及的潜在的安全性问题。而设计基于CTL表位的结核多肽疫苗的首要工作则是结核抗原表位的鉴定，但迄今为止，已被鉴定出的结核杆菌 CTL表位的数量很少［10，13-15］。该研究中，作者通过“反向免疫学”方法从HLA-A*0201候选肽中鉴定CFP21的HLA-A*03表位，该方法是目前常用的一种比较有效的鉴定HLA限制性CTL表位的方法。作者以在线数据库 SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL 1.2为基础，对比 HLA-A*0201的预测结果［4］，初步筛选 CFP21的 HLA-A*03天然表位。已有文献［6］报道，通过对抗原表位锚定位点的氨基酸替换，能够增强表位与HLA-Ⅰ分子的结合力。因此，作者通过将天然表位按1Y、2L和(或)9L进行氨基酸置换，获得改造肽。通过T2A3细胞结合力的初步筛选，在7条候选肽中，只有母体肽 p134和相应的2条改造肽可用于后续的体外免疫活性检测。目前研究者大多采用ELISPOT、标准51Cr释放法和 LDH释放法［9］等检测收获的抗原特异性 CTL免疫活性。该研究中作者采用经丝裂霉素C处理和抗原肽孵育后的 DC为刺激细胞，与自身T淋巴细胞共培养，经3～4轮刺激后，收获抗原特异性CTL，通过LDH释放法检测其活性，结果显示，母体肽p134以及2条改造肽p134-1Y2L和p134-1Y2L9L都能够诱导CTL反应，但只有p134诱导出的CTL对靶细胞具有明显的杀伤效应。

综上所述，p134(AVADHVAAV)是一个针对HLA-A*03的表位。结合课题组前期对CFP21的HLA-A*0201限制性表位的研究，作者认为p134(AVADHVAAV)表位能有效激发HLA-A*0201/*03限制性CTL的免疫应答，是一个多等位基因广谱CTL表位。

［1］Rajasekaran S，Chandrasekar C，Mahilmaran A，et al.HIV coinfection among multidrug resistant and extensively drug resistant tuberculosis patients—a trend［J］.J Indian Med Assoc，2009，107(5):281

［2］Roy E，Lowrie DB，Jolles SR.Current strategies in TB immunotherapy［J］.Curr Mol Med，2007，7(4):373

［3］Grover A，Ahmed MF，Verma I，et al.Expression and purification of the Mycobacterium tuberculosis complex-restricted antigen CFP21 to study its immunoprophylactic potential in mouse model［J］.Protein Expr Purif，2006，48(2):274

［4］吕虹，高艳锋，祁元明.结核杆菌抗原CFP21/MTB12/Rv3881c的HLA限制性细胞毒T淋巴细胞表位预测［J］.郑州大学学报:医学版，2010，45(1):78

［5］Lv H，Gao Y，Wu Y，et al.Identification of a novel cytotoxic T lymphocyte epitope from CFP21，a secreted protein of Mycobacterium tuberculosis［J］.Immunol Lett，2010，133(2):94

［6］Wang B，Yao K，Liu G，et al.Computational prediction and identification of Epstein-Barr virus latent membrane protein 2A antigen-specific CD8+T-cell epitopes［J］.Cell Mol Immunol，2009，6(2):97

［7］Lazoura E，Apostolopoulos V.Rational Peptide-based vaccine design for cancer immunotherapeutic applications［J］.Curr Med Chem，2005，12(6):629

［8］Li F，Yang D，Wang Y，et al.Identification and modification of an HLA-A*0201-restricted cytotoxic T lymphocyte epitope from Ran antigen［J］.Cancer Immunol Immunother，2009，58(12):2039

［9］Ding FX，Wang F，Lu YM，et al.Multiepitope peptide-loaded virus-like particles as a vaccine against hepatitis B virus-related hepatocellularcarcinoma［J］.Hepatology，2009，49(5):1492

［10］Aoshi T，Nagata T，Suzuki M，et al.Identification of an HLA-A*0201-restricted T-cell epitope on the MPT51 protein-a major secreted protein derived from Mycobacterium tuberculosis，by MPT51 overlapping peptide screening［J］.Infect Immun，2008，76(4):1565

［11］Hovav AH，Fishman Y，Bercovier H.Gamma interferon and monophosphory lipid A-trehalose dicorynomycolate are efficient adjuvants for Mycobacterium tuberculosis multivalent acellular vaccine［J］.Infect Immun，2005，73(1):250

［12］Sablel SB，Kalra M，Verma I，et al.Tuberculosis subunit vaccine design:the conflict of antigenicity and immunogenicity［J］.Clin Immunol，2007，122(3):239

［13］陈燕，娄加陶，吴传勇，等.KLIANNTRV是结核抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL表位［J］.现代检验医学杂志，2007，22(5):1

［14］吴传勇，娄加陶，蒋廷旺，等.结核杆菌抗原 Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定［J］.第二军医大学学报，2007，28(4):349

［15］Frieder M，Lewinsohn DM.T-cell epitope mapping in Mycobacterium tuberculosis using pepmixes created by microscale SPOT-synthesis［J］.Methods Mol Biol，2009，524:369