吡咯烷二硫代氨基甲酸对食管癌细胞系EC1增殖、凋亡及细胞周期的影响*

常凯杰，田 芳，闫 苒，刘 彤，黄幼田，郑晓枫，赵继敏，江亚南#

1)郑州大学基础医学院临床医学系郑州450001 2)郑州大学基础医学院病理生理学教研室郑州450001

食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2%。核因子 κB(nuclear factorkappa B，NF-κB)是一类关键性的核转录因子，参与免疫应答、炎性反应、细胞凋亡以及肿瘤的形成和转移等多种生理、病理过程中的基因调控［1］。食管癌细胞系 EC1细胞中 NF-κBp65、NF-κBp50 蛋白表达阳性［2］，提示NF-κB基因可能参与了食管的癌变过程。抗氧化剂吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)是 NF-κB 的特异性抑制剂。目前，关于PDTC对食管癌细胞系影响的研究国内外未见报道。作者拟观察PDTC对食管癌细胞系EC1细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响，探讨PDTC用于辅助治疗，进而提高食管癌疗效的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料 小牛血清购自天津 TBD公司，RPMI 1640培养粉购自美国Gibco公司，MTT、二甲基亚砜(DMSO)及碘化吡啶(PI)均购自美国Sigma公司。Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自宝赛生物公司，细胞周期检测试剂盒购自美国BD公司。EC1细胞系由香港大学曹世华教授惠赠。

1.2 细胞培养 EC1细胞在含有体积分数10%的胎牛血清，100 kU/L青霉素，100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养液中，于37℃、体积分数为5%CO2孵箱中培养。0.2 g/L乙二胺四乙酸和0.5 g/L胰蛋白酶混合液消化、传代，备用。

1.3 PDTC对EC1细胞增殖影响的观察 取处于对数生长期的EC1细胞，调整细胞浓度为4×107L－1，接种于 96 孔板。分别加入 1、5、10、50 和 100 μmol/L的 PDTC 作用 24、48、72 h后(均设 5个复孔)，每孔加入MTT 20 μL，继续培养4 h后去上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，在酶标仪上以未加药的空白对照孔调零，490 nm处读取吸光度(A)值。细胞增殖抑制率=(1－实验孔A值/对照孔A值)×100%。

1.4 PDTC对EC1细胞凋亡影响的观察 取2×104个EC1细胞培养于培养瓶，分别用0、5、10、50和100 μmol/L的PDTC作用48 h后收集细胞，PBS液洗涤2遍，再用体积分数70%乙醇固定，4℃过夜，用AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂盒检测，行PI(50 mg/L)和V双染色，上流式细胞仪分析亚二倍体峰，分析细胞凋亡率。

1.5 PDTC对EC1细胞周期影响的观察 分别用0、5、10、50 和100 μmol/L 的PDTC 作用于EC1 细胞48 h后收集细胞，胰蛋白酶消化，离心，弃上清;PBS清洗，离心，弃上清，冰乙醇固定，4℃过夜。检测前，离心，弃乙醇，PBS洗2遍;加入1 mL PBS制成细胞悬液，加RNaseA(终质量浓度50 mg/L)，室温放置1 h，加1 mL PI(50 mg/L)，避光30 min，按试剂盒说明操作，上流式细胞仪检测。

1.6 统计学处理 采用 SPSS 13.0进行统计学处理。应用3×5析因设计的方差分析比较不同剂量PDTC作用不同时间后EC1细胞的增殖抑制率，应用单因素方差分析比较不同剂量PDTC作用48 h后EC1细胞的凋亡率和细胞周期的差异，检验水准α =0.05。

2 结果

2.1 不同剂量PDTC作用不同时间后EC1细胞增殖抑制率测定结果 见表1。

表1 不同剂量PDTC作用不同时间后EC1细胞增殖抑制率测定结果(n=5)%

2.2 不同剂量PDTC作用48 h后EC1细胞凋亡率和细胞周期测定结果 见表2。不同剂量PDTC作用48 h后，随着PDTC剂量的增加，细胞凋亡率增高，G0/G1期细胞减少，G2/M和S期细胞增多。

表2 不同剂量PDTC作用48 h后EC1细胞的凋亡率和细胞周期(n=5)%

3 讨论

越来越多的资料［3-4］表明，NF-κB转录因子与细胞增殖和凋亡、肿瘤的发生发展和侵袭转移以及肿瘤耐药关系密切。PDTC是NF-κB的特异性抑制剂。PDTC最初因其有金属离子螯合作用而主要用来治疗金属中毒，后来又作为免疫增强剂用于治疗获得性免疫缺陷综合征，此类药物可安全应用于人类［5-6］。有研究［7］证实 NF-κBp50 mRNA 在正常组织中未见表达，而食管癌细胞系EC1细胞则出现NF-κBp65、NF-κBp50 mRNA 的表达，提示 NF-κB 基因可能参与了食管癌的癌变过程。有文献［8-10］报道PDTC可抑制白血病细胞系K562细胞、人肺腺癌A549细胞和胃癌细胞株的增殖。作者发现，PDTC可剂量依赖性和时间依赖性地抑制食管癌EC1细胞的生长，而抑制最佳时间是48 h。

人类恶性肿瘤的发生、发展及预后与细胞凋亡相关基因的改变密切相关，诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的重要策略［11］。PDTC可诱导胃癌细胞发生凋亡［10］，并可增强卡铂对 HeLa细胞的促凋亡作用［12］。细胞周期被阻滞于不同的检查点，意义亦不相同。细胞阻滞在G1期检查点，可防止DNA受损的细胞进入S期复制;阻滞在S期检查点，可防止DNA复制不完全的细胞进入G2/M期;阻滞在G2期检查点，可防止细胞在 M期进行异常分裂［13］。该研究结果显示，用不同剂量PDTC作用于EC1细胞48 h，随着PDTC剂量的增加，EC1细胞凋亡率逐渐增加，S期细胞增多，说明PDTC使EC1细胞大量阻滞在S期，同时提示PDTC可诱导EC1细胞凋亡，为PDTC用于辅助食管癌化疗提供了理论依据。

综上所述，NF-κB抑制剂PDTC有抑制食管癌EC1细胞生长的作用，并可诱导EC1细胞发生早期凋亡并将其阻滞在S期，这为食管癌的临床治疗提供了一个新思路。

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