维药阿里红中2个新三萜酸成分

韩建欣　袁涛

[摘要] 该研究旨在阐明维药阿里红的药效物质基础。采用各种现代色谱手段（MCI，ODS，硅胶等柱色谱以及半制备高效液相色谱）从阿里红甲醇提取物中分离得到2个新的羊毛甾烷型三萜酸成分，通过一维，二维核磁共振、高分辨质谱等波谱手段鉴定其结构为12β， 15αdihydroxy24methyl3，23dioxolanosta7，9（11）dien26oic acid （1），3α， 12βdihydroxy24methyl7，23dioxolanosta8en26oic acid （2）。体外抗炎和细胞毒活性测试显示，化合物1和2均未表现出抑制LPS诱导RAW264.7细胞NO的产生，以及抑制肝癌细胞HepG2生长的活性。

[关键词] 维药； 阿里红； 三萜酸； 抗炎； 细胞毒

Two new triterpenoid acids from Uighur medicine Fomes officinalis

HAN Jianxin 1，2， YUAN Tao 1*

（1. The Key Laboratory of Plant Resources and Chemistry of Arid Zone， Chinese Academy of Sciences，

State Key Laboratory of Xinjiang Indigenous Medicinal Plants Resource Utilization， Xinjiang Technical

Institute of Physics and Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Urumqi 830011， China；

2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

[Abstract] Two new lanostane triterpenoid acids， 12β， 15αdihydroxy24methyl3，23dioxolanosta7，9（11）dien26oic acid （1）， and 3α， 12βdihydroxy24methyl7，23dioxolanosta8en26oic acid （2）， were isolated from the methanolic extract of Uighur medicine Fomes officinalis. Their structures were elucidated based on the analysis of spectroscopic data （1D， 2D NMR and HRMS）. Antiinflammatory and cytotoxicity assays revealed that both compound 1 and 2 show no inhibitory effects on nitric oxide production in lipopolysaccharideinduced RAW264.7 cells， and no cytotoxicity activities against HepG2 cells.

[Key words] Uighur medicine； Fomes officinalis； triterpenoid acid； antiinflammatory； cytotoxicity

阿里红Fomes officinalis （Vill. Ex Fr.） Ames，又名苦白蹄、落叶松茸，维吾尔语音译为“哈里坤”，为一种药用真菌子实体，属于多孔菌科Polyporaceae层孔菌属Fomes，主要分布于新疆、东北、内蒙古等地[1]。阿里红是我国新疆维吾尔民族医生常用的治疗药物之一，民族医生认为其入药性燥、热，有温胃祛痰、降气平喘、祛风除湿等功效，常用于治疗慢性支气管炎及哮喘等症状[1]。前期文献调研发现，阿里红中的化学成分主要包括三萜酸类成分、倍半萜、甾体类化合物、多糖以及一些其他的直链烷烃类结构，其中以三萜酸类成分最多[26]。阿里红中分离得到的单体化合物的药理活性的研究很少，大多集中在提取物以及阿里红多糖的药理作用研究，主要有抗肿瘤、抗氧化、增强免疫以及平喘祛痰等作用[1]。基于本课题组对维吾尔医常用药材药效物质基础的研究兴趣，前期已经从阿里红的甲醇提取物中分离得到9个三萜酸类成分，且部分化合物表现出显著的抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生NO作用[7]。在前期工作的基础上，本课题组进一步对阿里红的化学成分进行了研究，通过采用各种现代色谱手段（MCI，ODS，硅胶等柱色谱以及半制备高效液相色谱），从中又分离得到2个新的羊毛甾烷型三萜酸类成分，它们的结构经一维，二维核磁共振、高分辨质谱等波谱手段鉴定为12β，15αdihydroxy24methyl3，23dioxolanosta7，9（11）dien26oic acid（1），3α，12βdihydroxy24methyl7，23dioxolanosta8en26oic acid（2）。對化合物1和2进行了LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的抑制作用以及HepG2细胞毒活性的评价。

1 材料

Varian 400 MHz核磁共振仪；美国鲁道夫Autopol VI旋光仪；美国Thermo Fisher Nicolet 6700红外光谱仪；ABsciex TripleTofTM 5600+高分辨质谱仪；日立Chromaster高效液相色谱仪；瑞士步琦旋转蒸发仪；Phenomenex Luna C18 column （10 mm×250 mm，5 μm）半制备色谱柱；ODS （50 μm，日本YMC）；凝胶Sephadex LH20 （瑞典GE Healthcare BioSciences）； MCI （CHP20P，75～150 μm，日本三菱化工）；柱色谱硅胶（200～300目）及薄层色谱用GF254硅胶预制板，均为青岛海洋化工厂生产；提取分离所用分析纯试剂均购于探索平台（上海）；半制备所用色谱纯试剂为SigmaAldrich；SANYO MCO18AIC细胞培养箱；SpectraMax M2多功能酶标仪为美国Molecular Devices 公司；DMEM培养基为美国Hyclone；阳性对照地塞米松购于中检所；腹腔巨噬细胞RAW264.7和肝HepG2购于中科院上海细胞所。

阿里红2014年11月购于新疆维吾尔自治区维吾尔医医院，经新疆农业科学院微生物研究所杨新平副研究员鉴定为F. officinalis子实体，其凭证标本存放于中科院新疆理化技术研究所中科院干旱区植物资源化学重点实验室，标本号为FO201411。

2 提取与分离

室温干燥的阿里红子实体（1.0 kg），粉碎，用纯甲醇室温浸提3次，每次用4.5 L甲醇浸泡7 d。提取液减压浓缩得浸膏575.9 g。甲醇提取物浸膏分散在蒸馏水中依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取得到2个萃取物浸膏。乙酸乙酯萃取浸膏（135.8 g）经过MCI柱色谱，以甲醇水（50∶50～100∶0）梯度洗脱得到5个流分（A～E）。B流分（8.4 g）采用正相硅胶柱色谱，以氯仿甲醇（100∶1～1∶1）梯度洗脱得到7个流分（B1～B7）。B5（2.5 g）经反相C18硅胶柱色谱分离甲醇水（6∶4～1∶0）洗脱得到8个流分（B5a～B5h）。B5a（462.5 mg）经凝胶Sephadex LH20柱色谱分离纯甲醇洗脱得到7个流分（B5a1～B5a7）。B5a4（182.0 mg）经正相硅胶柱色谱分离氯仿甲醇（30∶1～10∶1）梯度洗脱得到6个流分（B5a4a～B5a4f）。B5a4a（103.2 mg）经半制备HPLC（0～25 min， 60%～80%甲醇，流速为3 mL·min-1）制备得到化合物1（7.8 mg）。B5b（562.4 mg）经正相硅胶柱色谱分离氯仿甲醇（100∶1～5∶1）梯度洗脱得到6个流分（B5b1～B5b6）。B5b6（48.8 mg）经半制备HPLC（0～20 min，65%～77%甲醇，流速为3 mL·min-1）制备得到化合物2（5.1 mg）。

3 抗炎和细胞毒活性筛选

一氧化氮（NO）含量测定是采用Griess方法。具体如下：取对数生长期的RAW264.7细胞，按每孔7×105个细胞数接种于6孔板中，24 h后加入受试化合物（终浓度分别为40，13.3，4.33 μmol·L-1），1 h后加入LPS （1 mg·L-1）刺激24 h，无细胞上清液（50 μL）和50 μL 1%磺胺在5%磷酸溶液混合后在暗室下室温孵育5 min，然后加入0.1%N（1萘基）乙二胺溶液50 μL，在酶标仪540 nm波长下读数，以NaNO2标准曲线校准。地塞米松作为阳性对照药品。细胞毒活性测试采用的是常规的MTT法。抑制率按照以下计算：抑制率=（A模型-A给药）/A模型×100%。

4 結构鉴定和抗炎活性

化合物1 白色无定型粉末，[α]20D +10° （c 0.200，MeOH）；UV （MeOH） λmax 246 nm； IR νmax 3 376，2 926，1 699，1 566，1 453，1 408，1 022 cm-1；HRESIMS m/z 513.319 8 [M-H]-（计算值C31H45O6，513.321 6），结合核磁数据确定其分子式为C31H46O6，不饱和度为9。

从该化合物的1HNMR谱，见表1，可以清晰的观察到5个叔碳甲基（δ 1.26，1.14，1.07，0.97，0.97，each 3H，s），3个仲碳甲基（δ 1.08，1.00，0.99，each 3H，d），2个烯氢信号（δ 6.00，br d，J=6.9 Hz，H7； 5.24，br s，H11），以及2个连氧次甲基质子信号（δ 4.29，dd，J=8.9，6.3 Hz，H15； 4.24，br s，H12）。该化合物的13CNMR，见表1，显示了31个碳信号，结合HSQC谱将其分别归类为8个甲基、5个亚甲基、9个次甲基（其中包括2个sp2杂化碳）和9个季碳（其中包括3个羰基碳）。综合分析以上数据推测该化合物可能为24甲基羊毛甾烷型三萜[8]。在以上这些信息的基础上，进一步详细分析二维NMR（包括1H1H COSY，HSQC和HMBC）谱，该化合物的结构得以确定。首先由HSQC完成氢和与之相连的碳的归属，然后由1H1H COSY谱得出，见图2，自旋偶合结构片断（粗线表示的），然后这些片断再通过一些关键的HMBC 相关和其他一些官能团连接起来。在HMBC谱中，可以观察到Me19和C1（δ 36.3），C5（δ 50.6），C9（δ 145.4），C10（δ 36.8）；Me28（Me29）和C3（δ 217.5），C4（δ 47.1），C5，C29（C28）；H7和C9；H11和C8（δ 140.2）；Me18和C12（δ 73.5），C13（δ 49.3），C14（δ52.4），C17（δ 48.6）；Me30和C8，C13，C14，C15（δ 72.8）；Me21和C17，C20（δ 29.7），C22（δ 48.0）；H22和C23（δ 216.0）；Me31和C23，C24（δ 49.5），C25（δ 44.3）；Me27和C24，C25，C26（δ 182.7），见图2a；以上这些HMBC相关就此构建了化合物1的平面结构。

化合物1的相对构型主要采用NOESY谱确定，见图2b。首先通过观察NOESY谱可以发现H329和H319，H319和H318；H318和H15之间的相关，表明Me29，Me19，Me18和H15处于同一面，将它们定为β构型；那么根据NOESY观察到的H328和H5；H12和H330，H17之间的相关可以推测出Me28，H5，H12，Me30和H17为α构型。C17侧链的立体构型则通过生源关系并对比它们的核磁数据得以确定[7]。因此，化合物1的结构确离得到的化合物officimalonic acid D非常相似[6]，唯一的区别在于化合物2缺少officimalonic acid D的3位丙二酸半酯的核磁信号，且化合物2的3位氢信号和碳信号均向高场分别位移了1.33和4.2（2：δH3.38，δC 74.0，officimalonic acid D：δH 4.71，δC 78.2），因此，推测化合物2的3位OH没有被酰化。HMBC相关信号Me28（Me29）和C3，C4，C5和C29（C28）进一步支持了上述推断。最后经过综合分析详细分析2D NMR（包括1H1H COSY，HSQC，HMBC，NOESY）谱最终确定了化合物2的结构见图1，命名为12βdihydroxy24methyl7，23dioxolanosta8en26oic acid，经Scifinder检索为新化合物。

化合物1和2的绝对构型是通过生源关系以及和已知类似化合物[9]的核磁数据对照得以确定见图1。

5 结果与讨论

24甲基羊毛甾烷型三萜为多孔菌科真菌的特征性成分，前期从该科真菌中分离得到了大量的该类成分[10]，结构变化主要集中在C17侧链，C3，C12和C15的取代基，C7，C8，C9和C11是否以双键形式存在。前期其他课题组对阿里红的研究也报道了该类三萜成分[25]，课题组前期已经从阿里红中分离得到9个该类型的三萜结构（其中8个为新化合物）[7]，很有意思的是前期分离得到的化合物的3位都取代了1个丙二酸半酯的结构片断，这种结构特征在多孔菌科的其他种中报道过[11]，但很少在阿里红中有报道，并且部分化合物表现出了很强的抗炎活性，而本次报道的2个化合物的3位都没有丙二酸半酯的片断，且没有表现出抗炎活性，所以推测抗炎活性可能与这一结构特征有相关性。但是这种相关性需要进一步的实验来验证。通过本研究的结果表明阿里红中的具有丰富的24甲基羊毛甾烷型三萜，其结构变化多样，非常值得深入发掘。

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[责任编辑 丁广治]