甘蓝型油菜二酰甘油酰基转移酶基因微藻真核表达载体的构建*

张楠楠，潘卫东，郑国庭，李 靓，崔玉琳，秦 松，薛乐勋#

1)郑州大学生物工程系细胞生物学研究室郑州4500012)郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室郑州450001 3)宁波大学海洋生物技术重点实验室宁波315211 4)中国科学院海洋研究所青岛266071 5)中国科学院烟台海岸带研究所烟台264003

二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)是催化生物合成三酰甘油最后一步的关键酶，在动植物中普遍存在［1］。研究［2］表明:DGAT是三酰甘油生物合成途径中惟一与三酰甘油合成速率保持一致的限速酶，其主要作用是催化二酰甘油加上酰基脂肪酸形成三酰甘油。DGAT1和DGAT2尽管在基因结构上有差异，但在生物合成三酰甘油中的作用相似，DGAT1在三酰甘油代谢中具有更广泛的作用，而DGAT2更侧重于特殊脂肪酸的积累，二者均能执行三酰甘油合成途径的最后一步［3］。微藻由于光合效率高、生物产量高、生长繁殖快、生长周期短和自身合成油脂能力强的特点被认为是生物柴油的巨大资源库［4］。作者利用RT-PCR技术克隆了甘蓝型油菜中已知的DGAT1和DGAT2基因的cDNA序列，并构建了以SV40启动子驱动目的基因表达，以Bar基因作为筛选标记的微藻真核表达载体，探讨以微藻生产生物柴油的途径。

1 材料与方法

1.1 材料、菌株和主要试剂 甘蓝型油菜(Brassica napus)高油609为商品化种子，大肠杆菌 DH5α、pSV40rPA/CaMVBar系实验室保存，pMD18-T Simple载体、限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ及Taq DNA聚合酶均购自大连宝生物工程公司，RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司，AMV第一链cDNA合成试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，凝胶回收试剂盒和质粒DNA提取试剂盒购自杭州维特洁生物公司。

1.2 目的基因DGAT1和DGAT2的扩增 取适量甘蓝型油菜高油609种子萌发后10 d的叶片，用焦碳酸二乙酯处理的蒸馏水配制的PBS清洗3次，迅速置于液氮中充分研磨，利用Trizol试剂提取总RNA，通过10 g/L的琼脂糖凝胶电泳判断RNA的完整性。以提取的甘蓝型油菜总RNA为模板，按AMV第一链cDNA合成试剂盒说明书合成cDNA第一链。依据GenBank中已知的甘蓝型油菜DGAT1(登录号 AF164434)和 DGAT2(登录号AF155224)的序列设计引物。上游引物引入XhoⅠ酶切位点，下游引物引入XbaⅠ酶切位点，引物序列如下。DGAT1上游引物:5’-CCGCTCGAGATGGC GATTTTGGATTCT-3’，DGAT2 上游引物:5’-CCG CTCGAGATGTGTTGTCTCTCCCTT-3’，DGAT1 和DGAT2下游引物相同(5’-GCTCTAGATCAGGACAT GGATCCTTT-3’)。扩增条件:94℃预变性5 min;94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 100 s(DGAT1)或72℃70 s(DGAT2)，30个循环;72℃延伸10 min，4℃终止。反应结束后，PCR产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 连接和测序鉴定 PCR产物经凝胶回收后，连接到pMD18-T Simple载体上，转化感受态大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取阳性菌落，通过菌液PCR进行鉴定。鉴定正确的阳性克隆由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果进行Blast比对分析。

1.4 DGAT真核表达载体的构建及鉴定 利用限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ分别对pSV40rPA/CaMVBar、pMD18-T Simple/DGAT1 和 pMD18-T Simple/DGAT2进行双酶切，分别回收载体片段和目的片段，16℃连接过夜，转化感受态大肠杆菌DH5α，得到重组的微藻真核表达载体pSV40DGAT1/CaMVBar和pSV40DGAT2/CaMVBar，并对质粒进行酶切鉴定。

2 结果

2.1 DGAT1和DGAT2基因RT-PCR扩增结果甘蓝型油菜DGAT1和DGAT2基因经RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分别检测出在约1 500 bp和1 000 bp处有明显亮带(图 1)，测序结果显示DGAT1 为1 512 bp，DGAT2为1 026 bp，与GenBank中已知序列的同源性分别为99%和98%，得到的DGAT1和DGAT2基因是完整的编码区序列。

图1 甘蓝型油菜DGAT1和DGAT2基因RT-PCR结果

2.2 pSV40DGAT1/CaMVBar 和 pSV40DGAT2/CaMVBar真核表达载体的鉴定 用XhoⅠ和XbaⅠ 对构建的 pSV40DGAT1/CaMVBar和pSV40DGAT2/CaMVBar载体进行双酶切鉴定(图2)，结果显示载体构建正确。

图2 pSV40DGAT1/CaMVBar和pSV40DGAT2/CaMVBar真核表达载体的鉴定

3 讨论

微藻是一类系统发生各异、个体较小、通常为单细胞、能进行光合作用的水生低等植物，其每年吸收的CO2约占全球净光合产量的40%，在能量转化和碳元素循环中起到举足轻重的作用，并且容易生长和收获，产量很高［5］，许多科学家认为通过微藻来生产生物能源极具开发前途。

目前对转基因拟南芥、大豆和烟草等物种的研究［6］表明，过量表达DGAT基因可以促进三酰甘油积累。已证明［7］启动子CaMV35S和SV40在多种微藻中能够有效驱动外源基因的表达，而Bar基因作为微藻中安全有效的筛选标记，也已经被广泛使用。

该实验通过RT-PCR从甘蓝型油菜中克隆得到DGAT1和DGAT2 cDNA编码区序列，将其定向连接到真核表达载体上，构建出可转化多种微藻的以SV40启动子驱动目的基因DGAT1和DGAT2表达、以Bar基因作为筛选标记的pSV40DGAT1/CaMVBar和pSV40DGAT2/CaMVBar真核表达载体，为提高微藻油脂含量、进一步筛选出安全高效且适用于高油脂工程的藻种打下了基础。

［1］Settlage SB，Kwanyuen P，Wilson RF.Relation between diacylglycerol acyltransferase activity and oil concentration in soybean［J］.JAOCS，1998，75(7):775

［2］Sukumar V，Sastry PS.Triacylglycerol synthesis in developing seeds of groundnut(Arachis hypogaea):studies on phosphatidic acid phosphatase and diacylglycerol acyltransferase during seed maturation［J］.Biochem Int，1987，14:1153

［3］王龙龙，彭振英，邵媛媛，等.植物二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT)研究进展［J］.西北植物学报，2009，29(9):1924

［4］韩笑天，郑立，孙珊，等.海洋微藻生产生物柴油的应用前景［J］.海洋科学，2008，32(8):76

［5］Miyamoto K.FAO Agricultural Services Bulletin-128.Renewable biological systems for alternative sustainable energy production［M］.Rome:Food ＆ Agriculture Org，1997:3

［6］Colette Jako，Arvind Kumar，Yangdou Wei，et al.Seedspecific over-expression of an arabidopsis cDNA encoding a diacylglycerol acyltransferase enhances seed oil content and seed weight［J］.Plant Physiol，2001，126(7):861

［7］Zhang Y，Jiang P，Gao J，et al.Recombinant expression of rt-PA gene(encoding Reteplase)in gametophytes of the seaweed Laminaria japonica(Laminariales，Phaeophyta)［J］.Sci China C Life Sci，2008，51(12):1116