替勃龙对大鼠神经细胞Bcl-2、Bax表达的影响

宋月平 苏立凯 钟娅莉 田文艳

研究发现，雌激素替代治疗能使绝经期女性卒中的相对危险度(RR)及与卒中相关的病死率下降［1］。然而雌激素替代治疗对脑卒中的影响机制迄今仍不十分清楚。本文观察了替勃龙在去势大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤中脑缺血神经细胞凋亡及其相关蛋白表达的影响，旨在探讨它们对缺血性脑损伤的神经保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

1.1.1 实验动物 5月龄健康雌性SD大鼠30只，体重250～270 g，由河北医科大学实验动物中心提供(动物使用许可证号:SCXK2003-1-003)。试验期间所有动物置于同一室内，二级环境分笼饲养，自由饮水，室温(21±4)℃，光照12 h，黑暗12 h。

1.1.2 实验分组:将上述SD大鼠按体重随机分为3组:假手术组、对照组、替勃龙组，每组10只。假手术组行下腹切开，见到双侧卵巢，但不切除任何组织;其余2组于脑缺血术前14 d切除双侧卵巢。替勃龙组，替勃龙(荷兰欧加农生产，南京欧加农制药分装)0.25mg·kg－1·d－1，灌胃;对照组每日同等量蒸馏水灌胃。凡术中出现大鼠死亡，蛛网膜下腔出血或未存活到规定的时间点者，均为模型制作失败，不纳入本实验，再随机从备用组补充相应的大鼠，以保证每组实验大鼠数量不变。

1.2 脑缺血再灌注模型制作 用改良Longa法制作大脑中动脉阻断(MCAO)模型［1］。以10%水合氯醛(0.33 g/kg)腹腔注射麻醉后，暴露并钝性游离左侧颈总动脉(CCA)，结扎同侧CCA近心端和颈外动脉(ECA)分叉部，距CCA末端约5 mm处剪口，用直径0.24 mm的日本尼龙线沿颈内动脉(ICA)方向插入，深度由分叉部算约计(18.5±0.5)mm，于ICA近心端结扎该动脉，全层缝合切口，再灌注时抽出尼龙线10 mm。以动物清醒后爬行时向右转圈(追尾现象)，严重时向右跌倒，提尾时右前肢内收屈曲，为入选标准。于脑缺血手术2 h后再灌注，24 h后断头取脑。

1.3 观察指标

1.3.1 神经功能评分:参考Bederson等［2］的5分制评分标准，于取脑前评分。0分:无神经损伤症状;1分:不能完全伸展右侧前爪;2分:向右侧转圈;3分:向右侧倾倒;4分:不能自发行走，丧失意识。包括术后24 h内死亡。

1.3.2 脑梗死体积测定:大鼠脑缺血2 h，再灌注24 h后断头取脑。取左侧大脑半球，冠状面均匀切成2 mm厚脑片，染色固定，照相测量并计算出总的梗死体积。用计算机多媒体彩色图像分析系统测量脑梗死体积。

1.3.3 免疫组化细胞凋亡的检测:大鼠脑缺血2 h，再灌注24 h后断头取脑，距额极3～5 mm冠状切取材，放入4%多聚甲醛固定24 h后，制成石蜡切片，用于免疫组织化学染色。①采用TUNEL法原位标记DNA片段检测凋亡细胞。具体步骤参照产品说明书，原位细胞凋亡检测试剂盒为美国ROCHE公司出品。②采用链酶菌抗生物素蛋白过氧化物酶法(streptavidin peroxidase，SP)检测抗凋亡基因Bcl-2、细胞凋亡诱导因子Bax的表达。Bcl-2、bax多克隆抗体购于河北博海生物工程有限公司。③采用多功能真彩色细胞图像分析管理系统(美国Media Cybernetics公司Image-Pro Plus)。在光镜下分析图象，每张切片采集缺血周边区具有代表性10个高倍视野，计算平均数。

1.4 统计学分析应用SPSS 10.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较进行方差分析，两两比较采用q检验，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能评分 假手术组神经功能评分为(1.1±0.4)分，替勃龙组(2.3 ±0.5)分，假手术组为(1.3 ± 0.5)分，假手术组和替勃龙组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 梗死体积 替勃龙组与对照组比较梗死体积缩小，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表1。

表1 3组脑缺血模型大鼠梗死体积比较 n=10，

表1 3组脑缺血模型大鼠梗死体积比较 n=10，

注:与假手术组比较，*P ＜0.05;与对照组比较，#P ＜0.05

组别 半球体积(mm3) 梗死体积(mm3) 梗死体积百分比(%)260 ±8 47 ±5 18.2 ±2.2对照组 260±7 65±4* 25.3±2.4*替勃龙组 260±8 47±4# 18.2±2.2假手术组#

2.3 TUNEL标记结果 缺血组对侧仅见数个阳性细胞散在分布，缺血侧可见大量黄棕色阳性细胞，以圆形为主。假手术组阳性细胞数10%，替勃龙组阳性细胞数11%，对照组阳性细胞数28%，与对照组比较替勃龙组阳性细胞数明显减少，差异有统计学意义(P ＜0.01)。见图1。

2.4 Bcl-2、Bax在同侧皮层表达的百分率 在脑组织切片中，Bcl-2、Bax阳性表达表现为胞质棕黄色深染。替勃龙组较对照组Bcl-2阳性细胞增多，Bax阳性细胞减少，差异有统计学意义(P ＜0.01)。见表2。

图1 3组缺血侧皮层阳性细胞(TUNEL×400)

表2 3组脑缺血模型大鼠脑皮层Bcl-2、Bax表达水平比较 n=10，

表2 3组脑缺血模型大鼠脑皮层Bcl-2、Bax表达水平比较 n=10，

注:与假手术组比较，*P ＜0.01;与对照组比较，#P ＜0.01

Bcl-2/Bax假手术组组别 Bcl-2表达(%) Bax表达(%)32.0 ±2.1 12 ±1 2.65 ±0.05对照组 5.2 ±1.0* 60 ±2* 0.09 ±0.01*替勃龙组 33.1 ±2.2# 11 ±1# 3.00 ±0.10#

3 讨论

有研究证实外源性雌激素可以明显降低实验性MCAO大鼠的病死率，减少脑梗死面积，证明外源性雌激素具有缺血性神经保护作用［3］。据报道在大脑中动脉栓塞所致的局灶性脑缺血后，增加脑内的Bcl-2的表达，可减少神经细胞的凋亡，提示Bcl-2在缺血性脑损伤的病理发生中可能起内源性保护作用。Bcl-2家族是目前研究较为深入的与凋亡密切相关的基因，它既能阻抑坏死又能阻抑凋亡［4］。研究证明，线粒体外膜通透性的改变可引起细胞凋亡，而这种通透性的改变直接由Bcl-2家族蛋白控制［5］。Bcl-2家族包含一组相关蛋白，根据其成员在细胞凋亡中的作用分为两类:一类为抗凋亡蛋白，包括Bcl-2;另一类为促凋亡蛋白，包括Bax［6］。抗凋亡蛋白成员和促凋亡蛋白成员之间的协同作用共同决定细胞是否进入凋亡程序。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最重要的一对互相拮抗的凋亡相关因子，Bcl-2/Bax的比值在中枢神经细胞凋亡中起关键作用，比值高，细胞存活率高;比值低，细胞存活率低。测定Bcl-2/Bax比值有利于判断是否发生凋亡。以往研究显示一过性局灶性脑缺血后促凋亡蛋白Bax表达明显增加，且Bax阳性反应位于 TUNEL阳性的细胞内，其时程与空间的分布与TUNEL阳性神经元一致［6］，提示Bax在介导缺血性神经元损伤中起重要作用，这与本实验研究结果相符合。本实验观察到替勃龙用药组Bcl-2蛋白表达阳性细胞数不同程度增加，而Bax的蛋白阳性细胞数不同程度下降，Bcl-2/Bax比值增加，说明替勃龙可能通过上调Bcl-2/Bax比值而对脑缺血再灌注所造成的损伤起到一定的保护作用。

本实验结果显示替勃龙通过增强缺血再灌注后脑组织内Bcl-2的表达，抑制Bax的表达，上调Bcl-2/Bax的比值，从而改善模型鼠缺血再灌注24 h后神经功能缺损评分，减轻脑梗死体积和脑水肿，表明替勃龙对局灶脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

1 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversile middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rate.Stroke，1989，20:84-91.

2 Bederson JB，Pitts LH，TsujiM，et al.Rat middle cerebral artery occlusion evaluation of the model and development of a neurologic examination.Stroke，1986，17:472-476.

3 Zhang YQ，Shi J，Rajakumar G，et al.Effects of gender and estradiol treatment on focal brain ischemia.Brain Res，1998，784:321-324.

4 Wei MC，Zong WX，Cheng EHY，et al.Proapoptotic BAX and BAK:a reguisite gateway to mitochondrial dysfunction and death.Science，2001，292:727-730.

5 Orrenius S.Mitochondrial regulation of apooptotic cell death.Toxicol Lett，2004，149:19-23.

6 Hsu SY，Hsueh AJ.Tissue-specific Bcl-2 protein partners in apoptosis:An ovarian paradigm.Physiol Rev，2000，80:593-614.