骨关节炎患者关节液中亚硫酸盐及P物质含量变化

柳庆坤 秦杏坤 平会 刘晓松 李亚贞 赵建伟

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种慢性退化性关节疾病，50岁以上者多发，膝关节疼痛是最常见、最突出的症状，常使患者行走困难，活动受限，甚至致残，严重影响日常生活［1］。临床上对OA患者的治疗，主要是缓减关节疼痛、改善关节功能，缺乏有效的方法控制和治疗OA。随着对OA的深入研究，人们逐渐认识到骨关节炎是由多种因素相互作用形成的，OA的生物学行为涉及到分子生物学、细胞生物学和机械力学等许多方面，目前普遍认为细胞因子在OA软骨的破坏上起关键作用，而关节疼痛主要与局部P物质的作用有关［2］。有关亚硫酸盐在炎症反应中的作用已有报道，它是一种中性粒细胞抗微生物因子和参与炎症反应的炎性介质［3］。而有关亚硫酸盐在骨关节炎发病过程中的作用尤其是与关节疼痛的关系尚未见报道，因此，我们拟通过收集中重度膝关节炎患者的关节液，测定其SO2及P物质的含量变化，初步探讨亚硫酸盐对骨关节炎发病的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2008年8月至2010年8月我院骨科住院患者36例，男12例，女24例;年龄50～75岁，中位年龄63岁;病史1.5～26.3 年，平均10.5 年。纳入标准［4］:(1)符合骨关节炎的诊断依据，分级标准为中重度;(2)至少6个月病史;(3)双侧膝关节炎者，以症状严重侧入选;(4)无心血管、肝、肾等重要脏器病变;(5)排除活动性胃肠病变者及曾发生过消化性溃疡或胃十二指肠出血病史;(6)排除类风湿关节炎、感染性关节炎等其他关节疾患。所有病例均为我科初诊患者，就诊时近6个月未使用其他止痛药物、皮质类固醇药物及具有消炎镇痛作用的中药制剂。

1.2 临床分组及标本留取 所有患者均在无菌操作下抽取患侧膝关节液，然后注射玻璃酸钠注射液2ml(山东福瑞达医药集团)，1次/周，连续5周。第8周末随访患者并在无菌操作下抽取患侧膝关节滑液。每次所取关节液至少2ml，所得标本3000 r/min，离心 10min，取上清液 200 μl，－70℃冻存。血清来自临床常规生化检测后剩余标本。根据患者病程共分为3组，每组36例:(1)急性期组:患者确诊膝关节炎，分级为中重度，需行关节腔减压治疗;(2)恢复期组:经5个疗程的关节腔内注射玻璃酸钠，第8周复查患者;(3)随访期组:经治疗后症状明显好转半年以上。3组一般资料比较差异无统计学意义(P ＞0.05)，具有可比性。

1.3 实验方法

1.3.1 亚硫酸盐含量测定:取关节液 100 μl，加入 70 μl硼氢化钠，室温孵育 30min，加入 5 μl mBrB，充分混匀，42℃孵育10min，然后加 40 μl高氯酸混匀，12400 × g，室温离心 10min，取上清，加 10 μl Tris液(2.0 mol/L，pH 值 3.0)轻轻混匀，12400 ×g，室温离心10min，留取上清液4℃避光保存。取标本 5 μl进样分析，流动相 A:甲醇:乙酸:水(5∶0.25∶94.75，体积比，pH值3.4)，流动相B:甲醇。甲醇洗脱梯度:0～5min 5%;5～10min 35%;10～17min 45%;17.01～22min 100%;22.01～27min 5%。流速:1.0ml/min。激发波长392 nm，检测波长479 nm。

标准曲线的测定:以Na2SO3作为标准品，稀释为如下浓度:0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4、6 μmol/L，按上述步骤处理后进行检测，绘制标准曲线。见图1。

图1 亚硫酸盐标准曲线

1.3.2 P物质、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)的检测:采用ELISA法检测，试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司，严格按说明操作，根据标准曲线求出样品中P物质、IL-1、IL-6和IL-8的含量。

1.4 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膝骨关节炎患者关节液中各因子含量变化 膝关节液中亚硫酸盐含量在恢复期较急性期显著降低，差异有统计学意义(t=12.975，P ＜0.01);而随访期关节液中亚硫酸盐含量较恢复期虽然有所降低，但差异无统计学意义(t=1.683，P＞0.05)。P物质、IL-1、IL-6和IL-8在膝关节液中的含量变化与亚硫酸盐基本一致，恢复期较急性期显著降低(t值分别为16.901、14.960、12.089 和 13.264，P ＜0.01);但是，随访期 P物质和IL-1较恢复期进一步降低，差异有统计学意义(t值分别为6.659和 7.221，P ＜0.01);而 IL-6和 IL-8虽然也有降低，但差异无统计学意义(t值分别为2.354和1.352，P ＞0.05)。

表1 膝骨关节炎患者关节液中各因子含量变化

表1 膝骨关节炎患者关节液中各因子含量变化

注:与恢复期比较，*P ＜0.05

项目 急性期 恢复期 随访期亚硫酸盐 (μmol/L)9.2 ±3.3 4.4 ±2.2 3.6 ±2.2 P物质(ng/L) 92±24* 72±19 60±16*IL-1(ng/L) 43±10* 23±9 10±6*IL-6(ng/L) 168±34* 120±19 106±21 IL-8(ng/L) 241±27*125±12 118±24

2.2 患者膝关节液中亚硫酸盐和P物质的相关性分析 OA患者的膝关节液中亚硫酸盐和P物质，具有相关性(r=0.804，P ＜0.05)。见图2。

图2 膝关节液中亚硫酸盐与P物质水平相关性分析

3 讨论

OA是一个复杂的多因子的关节退行性病变，其发病过程有多种机制参与。其中炎症是主要的发病机制，通过改变细胞因子体系参与OA的发病过程［4－7］。而OA患者的关节疼痛除与软骨下骨暴露和骨内压增高有关外，主要与P物质有关［8］。关节滑膜阻止中的P物质是一种强致痛物质，可直接激活滑膜组织的痛觉感受器(C类纤维)，而且刺激巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞，诱导这些细胞的吞噬作用、作用和血管的渗出。单核细胞受到P物质的刺激释放IL-1和肿瘤坏死因子以及其他细胞因子，这些炎性介质又可激活成纤维细胞和软骨细胞释放胶原酶和蛋白酶，后者进入关节液中刺激骨膜和末梢神经产生疼痛。国内已有学者通过测定轻、中、重度膝关节OA患者膝关节液中P物质与白介素1β的含量。发现OA组膝关节液中P物质和白介素1β浓度显著高于对照组;滑液中白介素1β浓度与OA严重程度呈正相关，滑液中P物质与OA严重程度呈正相关，滑液中白介素1β与P物质浓度呈正相关。认为P物质和白介素1β与膝OA的发病和病情发展密切相关;且两者在OA的发病及病情发展中可能发挥相互协同作用［2］。

近年来，有关气体信号分子在OA发病过程中的作用已有报道，Cillero-Pastor等［9］研究发现一氧化氮(nitric oxide，NO)可通过调节线粒体功能降低OA患者滑膜细胞的活性。Whiteman等［10］通过检测类风湿性关节炎、OA和健康志愿者的关节滑液中的硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)，发现三者血浆H2S无明显差异，而类风湿性关节炎关节滑液中的H2S含量显著高于骨关节炎和健康志愿者。由此可以看出，气体信号分子在关节炎的发病过程中发挥一定的病理生理学作用。

本研究结果发现，膝关节液中亚硫酸盐含量在恢复期较急性期显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05);而随访期关节液中亚硫酸盐含量较恢复期虽有所降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。P物质、IL-1、IL-6和IL-8在膝关节液中的含量变化与亚硫酸盐基本一致，恢复期较急性期显著降低。值得注意的是，随访期P物质和IL-1较恢复期进一步降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，这与文献报道一致［2］。骨关节炎患者的膝关节液中亚硫酸盐和P物质二者具有相关性，相关系数为0.804(P＜0.05)。进一步提示P物质与亚硫酸盐参与了骨性关节炎的发病，且与骨关节炎患者的疼痛具有一定的相关性。

总之，内源性亚硫酸盐在骨性关节炎的发病过程中发挥着一定的抗感染防御反应，同时也与局部的P物质协同引起关节的疼痛。但是，有关内源性亚硫酸盐参与骨性关节炎的炎症反应机制尚需进一步深入研究。

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6 Stannus O，Jones G，Cicuttini F，et al.Circulating levels of IL-6 and TNF-α are associated with knee radiographic osteoarthritis and knee cartilage loss in older adults.Osteoarthritis Cartilage，2010，18:1441-1447.

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9 Cillero-Pastor B，Martin MA，Arenas J，et al.Effect of nitric oxide on mitochondrial activity of human synovial cells.BMC Musculoskelet Disord，2011，12:42.

10 Whiteman M，Haigh R，Tarr JM，et al.Detection of hydrogen sulfide in plasma and knee-joint synovial fluid from rheumatoid arthritis patients:relation to clinical and laboratory measures of inflammation.Ann N Y Acad Sci，2010，1203:146-150.