全反式维甲酸抑制兔颈动脉内皮损伤后内膜增殖和聚集素表达的研究

李彦飞 王爱民 郑舒 董果雄

全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，atRA)是维生素A的 天然衍生物，它可通过调节多种生物活性因子的表达、阻滞细胞周期进程从而抑制血管平滑肌细胞(smooth muscle cell，SMC)的迁移、增殖，并促进凋亡，发挥抗血管内膜增殖作用［1，2］。聚集素是一个多功能蛋白质，它具有促进细胞聚集的作用，能促进血管平滑肌细胞增殖，对内皮损伤后血管内膜增殖也有不利影响［3］，本实验旨在观察血管内皮损伤后聚集素的表达情况和atRA对聚集素表达的影响，探讨atRA对血管再狭窄的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康新西兰雄性大白兔36只，4个月龄，体重(2.5±0.12)kg，购自青岛市动物实验中心。atRA(重庆华邦制药公司)，胆固醇(上海化学制剂公司)，兔抗兔聚集素，SABC试剂盒(武汉博士德公司)，鼠抗兔增殖细胞核抗原［(proliferating cell nuclear antigen，PCNA(北京中杉)］，ElivisionTM plus试剂盒(福州迈新)，Masson三色试剂盒(福州迈新)，奥林巴斯BX50显微镜，Image-Pro Plus图像分析系统。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制作:36只新西兰大白兔按体重随机分为6 组:治疗组(A、B)、对照组(A、B)、假手术组(A、B)，每组6只。治疗组和对照组每天进食150 g高脂饲料，含6.0%猪油、1.5%胆固醇、92.5%基础饲料;假手术组每天喂养150 g基础饲料;均自由饮水。喂养2周后行颈动脉内膜空气干燥术，假手术组手术但不损伤内膜。治疗组术前3 d开始给予atRA 6mg·kg－1·d－1，溶于 1ml植物油中灌胃至处死，对照组、假手术组给予等量植物油灌胃。

内膜空气干燥术:经耳缘静脉注射0.25 kg/L的乌拉坦1.0 g/kg，麻醉良好后颈部脱毛消毒，取颈正中纵形切口，分离右颈总动脉2.0cm，选择无分支段，动脉夹夹闭两端，4.5 G针头平行穿刺阻断血管的两端，0.9%氯化钠溶液冲洗血管腔，向夹闭段的颈总动脉内以120ml/min速度注入空气10min，管腔内重新注入0.9%氯化钠溶液，放开动脉夹，压迫穿刺处约10min止血，观察血流通畅后逐层缝合。术后给予青霉素40万 U，肌内注射，1次/d，连续3 d。

分别于术后第7天、28天处死A、B组动物，取病变部位血管等距切分4～5段，10%中性缓冲甲醛固定，石蜡包埋。血管标本横截面连续切片，厚度4 μm，间隔100 μm再次切片，共切3个层面。

1.2.2 形态学测定:切片行HE染色及Masson染色，显微镜下观察血管结构，用Image-Pro Plus进行图像分析，每例动物观察3张切片，测定每张切片上各个血管截面的内膜面积、中膜面积、内膜/中膜面积比、管腔狭窄度，管腔狭窄度=内膜面积/内弹力板下面积×100%，取平均值。

1.2.3 免疫组化检测聚集素、PCNA表达:用SABC三步法进行聚集素免疫组化染色，3%过氧化氢灭酶，微波修复，一抗稀释度1∶200，4℃过夜，DAB显色，苏木素复染，胞核及胞浆棕黄、棕褐色为阳性。PBS代替一抗作阴性对照。用IPP进行图像分析，随机测量每张切片中6个高倍视野的阳性部位平均光密度和阳性面积百分比，取其平均值，二者乘积乘以100为阳性表达指数。

二步法进行PCNA染色，微波修复，3%过氧化氢灭酶，一抗稀释度1∶100，室温孵育1 h，DAB显色，苏木素复染，胞核棕黄、棕褐色为阳性。PBS代替一抗作阴性对照。计数阳性胞核占总胞核比例，乘以阳性胞核平均光密度，二者乘积乘以100为PCNA阳性表达指数，其他分析过程同聚集素。

1.3 统计学分析应用SPSS 11.0统计软件，计量资料以表示，采用t检验或方差分析，组间比较采用S-N-K法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实验动物无死亡或患病，未发现手术部位感染，切口愈合良好。

2.1 血管组织形态情况 假手术组兔颈动脉血管内皮细胞完整，内膜无增厚，7 d和28 d血管结构无明显差别。对照组术后7 d时血管内皮再生，尚未完全覆盖管腔，内弹力板多处断裂，有SMC迁移入内膜，内膜开始增厚，可见泡沫细胞。28 d时血管腔表面凹凸不平，镜下见动脉内膜明显增厚，管腔狭窄，内膜层有大量SMC增生，排列紊乱，胞核形态不一。还可见到典型动脉粥样硬化偏心性狭窄，内膜有泡沫细胞聚集，中膜亦有SMC向泡沫细胞转变。治疗组病变与对照组相似，但术后28 d时内膜增厚程度明显轻于对照组，泡沫细胞较少。术后7 d时治疗组的内膜面积、内膜/中膜面积比、管腔狭窄度与对照组比较，差异无统计学意义(t=1.004～1.502，P ＞0.05)，术后28 d时治疗组的内膜面积、内膜/中膜面积比、管腔狭窄度均低于对照组(t=4.770，t=5.092，t=3.802，P ＜0.01)，术后7 d各组间、28 d各组间中膜面积差异无统计学意义(F=1.723、F=1.234，P ＞0.05)。见表 1。

表16 组血管形态学比较 n=6，

表16 组血管形态学比较 n=6，

注:与对照B组比较，*P ＜0.01

组别 内膜面积(A/mm2)中膜面积(A/mm2)内膜/中膜面积比管腔狭窄度(%)假手术A组 — 0.33±0.05— —假手术B组 — 0.33±0.06 — —对照 A 组 0.14 ±0.07 0.38 ±0.07 0.36 ±0.12 20 ±9对照 B 组 0.37 ±0.10 0.39 ±0.07 0.94 ±0.19 48 ±10治疗 A 组 0.11 ±0.05 0.37 ±0.06 0.29 ±0.11 14 ±6治疗 B 组 0.15 ±0.04* 0.36 ±0.07 0.44 ±0.14* 22 ±10*

2.2 atRA对聚集素、PCNA表达的影响 假手术组术后7 d、28 d未见聚集素表达。对照组术后7 d时，聚集素在新生内皮层和中膜SMC表达，术后28 d时(图1)表达增强，血管各层均有表达，细胞间质也有表达，在新生内膜深面及中膜靠近内弹力板处、粥样硬化斑块部位明显，可见泡沫细胞表达。治疗组聚集素表达部位规律与对照组相同，但术后7 d、28 d时(图1)阳性表达指数低于对照组。见表2。

图1 空气干燥术后28 d聚集素表达(免疫组化×200)

2.3 假手术组偶见微量PCNA表达 对照组术后7 d时，PCNA在新生内膜和中膜强表达，阳性胞核体积较大，有异型性，术后28 d时阳性表达指数下降，内皮细胞、SMC及泡沫细胞表达。治疗组表达部位规律与对照组一致，但7 d、28 d时表达均明显低于对照组(P ＜0.05或 ＜0.01)。见表2。

表2 atRA对聚集素、PCNA阳性表达的影响 n=6，

表2 atRA对聚集素、PCNA阳性表达的影响 n=6，

注:与对照 A 组比较，*P ＜0.05，#P ＜0.01;与对照 B 组比较，△P ＜0.01

PCNA对照A组组别 聚集素5.5 ±1.4 31.9 ±7.5对照 B 组 9.6 ±1.8 19.4 ±4.9治疗 A 组 3.5 ±1.0* 13.3 ±4.3#治疗B 组 6.4±1.6△ 8.3±2.6△

3 讨论

在本实验中我们应用PCNA来检测细胞的增殖状况，PCNA是DNA多聚酶δ的辅助蛋白，在DNA合成时促进DNA的延长，在G1期晚期和S期表达，是细胞进入并通过S期所必需的，可作为反映细胞增殖程度的可靠指标。

在高脂饮食和内皮损伤后，PCNA表达明显增加，在28 d时有所下降仍显著高于正常动脉，细胞呈现出一种过度增殖状态。应用atRA后明显减轻了血管PCNA的表达，表明atRA对血管壁的多种细胞、尤其SMC的增殖起到了抑制作用，进而下调了这种高增殖状态。

聚集素是一个分泌型的糖蛋白，它作用广泛，在体外具有促进细胞聚集的作用，和多种疾病如糖尿病、动脉硬化、肿瘤、肾脏及神经系统疾病有密切关系。Kim等［4］观察到聚集素通过抑制TNF-a刺激MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、MMP-9等的表达，抑制血管SMC的迁移，并能抑制血管SMC的DNA合成，腺病毒转染聚集素可以抑制球囊损伤大鼠颈动脉的新生内膜增厚，认为在血管损伤后聚集素的上调可能起到了保护性作用。但更多证据表明聚集素具有促进SMC的增殖和迁移的作用，并能抑制细胞凋亡［3，5］。抑制聚集素表达可以减轻血管SMC的增殖，聚集素基因敲除还可以减轻大鼠的动脉粥样硬化病变［6，7］。

我们观察到在血管内皮损伤后聚集素开始表达，自术后7～28 d呈升高趋势，强表达于新生内膜、中膜，细胞及细胞间质均有出现。在增生较重内膜、粥样硬化斑块部位最明显，与PCNA表达一致，表明它的过度表达刺激了血管内膜、中膜细胞的大量增殖，推测细胞间质的聚集素对细胞的迁移、丛聚也起到了促进作用，最终导致了血管内膜增殖、血管重塑。应用atRA后明显下调了聚集素的表达，与对照组比较差异显著。通过抑制聚集素的促血管SMC迁移、增殖等作用，atRA改善了内皮损伤后的血管重塑。这与Orlandi等［5］的结果一致。研究表明聚集素和动脉粥样硬化相关，血清聚集素水平可以作为冠心病的标记物之一［8］。其可行性有待进一步证实。

本实验结果表明，高脂饮食及内皮损伤后，血管组织聚集素持续、过多地表达，刺激了SMC等细胞迁移、增殖，最终导致了血管再狭窄病变形成。应用atRA能明显减轻内皮损伤后内膜增殖和血管再狭窄，抑制聚集素表达分泌是其机制之一。

1 褚现明，李冰，杜日映，等.P27对大鼠胸主动脉球囊损伤后管腔狭窄的作用.中国动脉硬化杂志，2006，14:417-421.

2 李彦飞，董果雄，张社华.全反式维甲酸对兔颈动脉内皮损伤后内膜增殖和VEGF及VCAM-1表达的影响.青岛大学医学院学报，2009，45:101-103.

3 Miyata M，Biro S，Kaieda H，et al.Apolipoprotein J/clusterin is induced in vascular smooth muscle cells after vascular injury.Circulation，2001，104:1407-1412.

4 Kim HJ，Yoo EK，Kim JY，et al.Protective role of clusterin/apolipoprotein J against neointimal hyperplasia via antiproliferative effect on vascular smooth muscle cells and cytoprotective effect on endothelial cells.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29:1558-1564.

5 Orlandi A，Pucci S，Ciucci A，et al.Modulation of clusterin isoforms is associated with all-trans retinoic acid-induced proliferative arrest and apoptosis of intimal smooth muscle cells.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25:348-353.

6 Shirasawa T，Miyata M，Eto H，et al.Deficiency of clusterin inhibits neointimal hyperplasia after vascular injury.J Atheroscler Thromb，2009，16:772-781.

7 Hamada N，Miyata M，Eto H，et al.Loss of clusterin limits atherosclerosis in apolipoprotein e-deficient mice via reduced expression of Egr-1 and TNF-α.J Atheroscler Thromb，2011，18:209-216.

8 Poulakou MV，Paraskevas KI，Wilson MR，et al.Apolipoprotein J and leptin levels in patients with coronary heart disease.In Vivo，2008，22:537-542.