河北道地药材紫菀中总黄酮的荧光分析

2012-04-29冯俊霞陆敏郭瑞霞戚秀菊

湖北农业科学 2012年15期

冯俊霞陆敏郭瑞霞戚秀菊

摘要：以槲皮素为标准品，用荧光分光光度法测定中药材紫菀（ＡｓｔｅｒｔａｔａｒｉｃｕｓＬ．ｆ．）中总黄酮含量，该方法的检出限为２．５１×１０－７ｇ／Ｌ，线性回归方程为ｙ＝５３１．８４０４８ｘ－３．５４４４８，相关系数Ｒ２＝０．９９９０３，线性范围为６．７×１０－６～６．０×１０－４ｇ／Ｌ；紫菀中总黄酮的平均含量为４．８９６×１０－３ｇ／Ｌ，样品测定的ＲＳＤ为０．９２％，平均回收率为９３．１９％。该方法操作简便、准确度高，可以为中药材紫菀质量控制提供参考。

关键词：紫菀（ＡｓｔｅｒｔａｔａｒｉｃｕｓＬ．ｆ．）；总黄酮；荧光分光光度法

中图分类号：Ｏ６５７．３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）15－3323-03

ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＴｏｔａｌＦｌａｖａｎｏｉｄｉｎＲａｄｉｘＡｓｔｅｒｆｒｏｍＨｅｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅｂｙＳｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ

ＦＥＮＧＪｕｎ－ｘｉａa，ＬＵＭｉｎa，ＧUO Ｒｕｉ－ｘｉａa，ＱＩＸｉｕ－ｊｕb

（ＳｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， a．ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； b．ＡｄｍｉｎｓｔａｔｉｖｅＯｆｆｉｃｅｏｆＳｔａｔｅＯｗｎｅｄＡｓｓｅｔｓ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００３５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎｗａｓｕｓｅｄａｓｓｔａｎｄａｒｄｍａｔｅｒｉａｌｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｔｏｔａｌｆｌａｖａｎｏｉｄｉｎ AｓｔｅｒｔａｔａｒｉｃｕｓＬ．ｆ．Ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｏｆｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｗａｓ２．５１×１０－７ｇ／Ｌ，ａｎｄｔｈｅｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｗａｓｂｅｔｗｅｅｎ６．７×１０－６～６.0×１０－４ｇ／Ｌ，ａｎｄｔｈｅｅｑｕａｔｉｏｎｏｆｌｉｎｅａｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｙ＝５３１．８４０４８ｘ－３．５４４４８， and ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔＲ２ was ０．９９９０３．Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅａｍｏｕｎｔｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖａｎｏｉｄｉｎ A. ｔａｔａｒｉｃｕｓｗａｓ４．８９６×１０－３ｇ／Ｌ， and ＲＳＤ was ０．９２％，ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙｗａｓ９３．１９％．Ｉｔｉｓ a ｓｉｍｐｌｅａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｍｅｔｈｏｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｏｔａｌｆｌａｖａｎｏｉｄｉｎ A. ｔａｔａｒｉｃｕｓｗｉｔｈｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒimetry．ＴｈｅｎｅｗｍｅｔｈｏｄｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｌａｎｔ A. ｔａｔａｒｉｃｕｓ.

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒａｄｉｘＡｓｔｅｒ（ＡｓｔｅｒｔａｔａｒｉｃｕｓＬ．ｆ．）；ｔｏｔａｌｆｌａｖａｎｏｉｄ；ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ

紫菀是菊科多年生草本植物紫菀（ＡｓｔｅｒｔａｔａｒｉｃｕｓＬ．ｆ．）的干燥根及茎，具有润肺下气、祛痰止咳之功效［１，２］，是河北省的道地药材之一［３］。黄酮类化合物是其主要药理活性成分，主要有槲皮素、山萘酚等［１，２，４］。本试验以槲皮素作为标准品，利用荧光分析法对紫菀中总黄酮含量进行了测定，为中药材紫菀的质量控制提供参考。

１材料与方法

１．１材料与试剂

紫菀，２０１１年１月购于石家庄新兴药房，由石家庄学院冯海燕副教授鉴定为菊科植物紫菀（ＡｓｔｅｒｔａｔａｒｉｃｕｓＬ．ｆ．）的干燥根及茎，该药材在６０ ℃真空干燥５ｈ，取出粉碎，置干燥器中备用。槲皮素对照品由中国药品生物制品检定所提供，经１２０ ℃真空干燥４ｈ，取出置于干燥器中冷却备用。Ａｌ（ＮＯ３）３·９Ｈ２Ｏ容易潮解，使用前５０ ℃真空干燥６ｈ。绿原酸由中国药品生物制品检定所提供。所用试剂均为分析纯。

１．２主要仪器

Ｆ－４５００型荧光分光光度计（日本日立公司）；ＫＱ３２００ＤＥ型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；雷磁ＰＨＳ－３ＣＰＨ计、ＦＡ２２０４Ｂ电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；ＤＺ－１ＢＣ真空干燥箱、ＦＷ１００高速万能粉碎机、ＤＫ－９８－１型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。

１．３试验方法

１．３．１样品溶液的制备称取粉碎的紫菀样品５．００ｇ，置于２５０ｍＬ三角瓶中，加入１５０ｍＬ６０％乙醇，浸泡５ｈ，用超声波破碎提取，参照文献［５］的方法并有所改进：超声温度为４０ ℃，料液比１∶３０（质量体积比），超声时间为４０ｍｉｎ，连续提取３次；提取完毕后，真空抽滤，合并３次滤液，６０％乙醇定容至２５０ｍＬ，待测。

１．３．２槲皮素标准溶液的制备准确称取槲皮素对照品０．００１５ｇ，用７０％乙醇溶解，定容至１００ｍＬ容量瓶中，配成浓度为１．５×１０－２ｇ／Ｌ的标准溶液。准确吸取１ｍＬ１．５９８ｇ／ＬＡｌ（ＮO３）３溶液，分别置于６只２５ｍＬ容量瓶中，各容量瓶中依次加入槲皮素标准溶液０、０．２、０．４、０．６、０．８和１．０ｍＬ，再加入２ｍＬＨＡc－ＮａＡc缓冲溶液（ｐＨ２．６５），用７０％的乙醇定容摇匀，室温下静置３０ｍｉｎ，待测。

１．３．３测定在激发光谱通带２．５ｎｍ、发射光谱通带５ｎｍ、激发波长λｅｘ＝４３６ｎｍ、发射波长λｅｍ＝４８６ｎｍ的条件下测定系列槲皮素标准溶液的荧光强度，以荧光强度对相应的浓度作图，绘制标准曲线，得到回归方程，然后在相同条件下测定紫菀样品溶液中总黄酮的荧光强度，利用回归方程计算其含量。

２结果与分析

２．１荧光化合物的激发及发射光谱

按照试验方法，配制浓度为３×１０－４ｇ／Ｌ的槲皮素标准溶液，在选定的合适激发光谱通带２．５ｎｍ，发射光谱通带５ｎｍ条件下，对其激发及发射光谱进行扫描，所得激发及发射光谱见图１。

２．２测定条件的选择

２．２．１溶剂的确定准确吸取１ｍＬ１．５９８ｇ／ＬＡｌ（ＮＯ３）３溶液，加入１ｍＬ１．５×１０－２ｇ／Ｌ槲皮素标准溶液，２ｍＬＨＡc－ＮａＡc缓冲溶液（ｐＨ２．６５），１ｍＬ１％ β－ＣＤ，分别用５０％、６０％、７０％、８０％、９０％的乙醇定容至２５ｍＬ，摇匀，室温下静置６０ｍｉｎ，在发射波长４８６ｎｍ处测定荧光强度。从图２可知，在４８６ｎｍ处槲皮素－铝配合物的荧光强度随着乙醇浓度的增加而增加，但当乙醇浓度达到８０％时，最大峰位置明显向长波方向移动。从测定结果及节约溶剂的角度出发，确定７０％乙醇为测定溶剂。

２．２．２ｐＨ的确定按照上述方法，用７０％乙醇作溶剂，分别在ｐＨ２．６５、３．３６、４．３７、５．１９时测定荧光强度。从测定结果（图３）可知，随着ｐＨ的升高，槲皮素－铝配合物的荧光强度迅速降低，ｐＨ２．６５时最大荧光强度为４０１．７，至ｐＨ５．１９时已经降低为６２．7；且最大峰位置不断向长波方向移动，至ｐＨ５．１９时，已经由ｐＨ２．６５时的４８６ｎｍ移动至５３１．４ｎｍ。根据以上测定结果，在本试验中加入２ｍＬＨＡc－ＮａＡc缓冲溶液（ｐＨ２．６５）。

２．２．３表面活性剂的确定选择了不加表面活性剂和加入３种不同的表面活性剂（ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、β－ＣＤ，浓度均为１％）来比较表面活性剂对槲皮素－铝配合物荧光强度的影响。从图４可知，加入表面活性剂并不改变峰的位置，ＳＤＳ对荧光有熄灭作用，β－ＣＤ和ＣＴＡＢ没有明显的增敏作用，因此在试验中选择不添加表面活性剂。

２．２．４温度的确定在上述选定的溶剂、ｐＨ条件下改变反应温度，分别在１３、３３、５３和７３ ℃下测定体系的荧光强度。从图５可以得出，温度能够显著影响体系的荧光强度，随温度的升高，体系的荧光强度显著降低，室温时最大荧光强度为４２６，而在７３ ℃时仅为２０３．２。温度对峰位置不产生影响，因此选择在室温下进行测定。

２．２．５反应时间的确定改变反应时间，在２０、４０、６０、８０和１００ｍｉｎ５个时间点测定槲皮素对照品的荧光强度，结果如图６所示，溶液的荧光强度在２０～４０ｍｉｎ内基本保持稳定且数值最高，在４０ｍｉｎ之后，荧光强度呈缓慢下降趋势，因此，选择３０ｍｉｎ为最佳测定时间。

２．２．６金属离子和绿原酸的干扰测定结果一些金属离子和有机酸对铝离子和槲皮素的结合存在配位竞争干扰，在上述选定的试验条件下，考察了常见的金属离子Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ２＋、Ｆｅ３＋和绿原酸对试验的影响。从图７可知，Ｃａ２＋和Ｍｇ２＋对测定没有干扰，Ｃｕ２＋使测定结果偏低，而Ｆｅ３＋的干扰最大，严重影响试验结果；绿原酸使测定结果偏高。

２．３标准曲线的绘制

在选定的最佳试验条件下，测得在６．７×１０－６～６．０×１０－４ｇ／Ｌ范围内槲皮素浓度与其荧光强度呈良好的线性关系。其线性回归方程为ｙ＝５３１．８４０４８ｘ－３．５４４４８，相关系数Ｒ２＝０．９９９０３。通过测定试剂空白溶液１２次，依据公式ＣＬＯＤ＝３Ｓ／Ｋ（Ｓ为空白溶液的标准偏差，Ｋ为工作曲线斜率）计算方法检出限为２．５１×１０－７ｇ／Ｌ。标准曲线见图８。

２．４样品测定及精密度

按上述试验方法测定了紫菀中总黄酮的含量，并对样品溶液进行平行测定（ｎ＝５），结果见表１，方法精密度良好。

２．５加标回收率

为了验证试验方法的准确性，做了加标回收试验，结果见表２，方法准确性良好。

３小结与讨论

利用荧光法测定中药材紫菀中的总黄酮含量，结果准确、精密度高；而且该方法操作简便，样品使用量少，测定成本较中药材黄酮含量测定常用的高效液相色谱法低，是一种比较实用的方法。

荧光分析受到许多因素的限制（ｐＨ值、温度、溶剂浓度等），所以该方法必须是在特定的条件下使用。中药材成分比较复杂，成分之间相互作用，对荧光分析结果可能产生影响，因此应加强提取过程研究。

参考文献：

［１］侯海燕，陈立，董俊兴．紫菀化学成分及药理活性研究进展［Ｊ］．中国药学杂志，２００６，４１（４）：１６１－１６３．

［２］库尔班江，欧阳艳，努尔买买提．紫菀属植物化学成分及药理作用研究进展［Ｊ］．中国野生植物资源，２０１０，２９（２）：１－４．

［３］范丽芳，王巧，张兰桐，等．河北道地药材紫菀的指纹图谱研究［Ｊ］．中草药，２００７，３８（１０）：１５６６－１５７０．

［４］田亚平，景秀娟，徐磊，等．ＨＰＬＣ法测定紫菀中阿魏酸、槲皮素和山奈酚［Ｊ］．中草药，２００８，３９（６）：９２６－９２８．