昆仑雪菊中总黄酮的提取及其对肿瘤细胞活性研究

刘苑星

摘要：采用乙醇回流提取法提取昆仑雪菊中的总黄酮物质，选取大孔树脂分离纯化昆仑雪菊中的总黄酮，用芦丁标准品制标准曲线检测总黄酮含量，回归方程为A=15.508C-0.0044，R2=0.9995。乙醇回流提取液中总黄酮含量为9.04%。通过MTT法测定黄酮对肿瘤细胞增殖的影响，记录统计实验数据，抑制率=1-（实验组A值一空白组A值）/（对照NA值一空白组A值）。抑制率≥30%判定药物敏感试验为阳性，抑制率≤30%判定药物敏感试验为阴性。

关键词：昆仑雪菊；总黄酮；肿瘤细胞；抑制率

前言

昆仑雪菊为新疆特有植物，学名双色金鸡菊，属菊科金鸡菊一年生草本植物，是具有降血压、降血脂等独特功效的稀有高寒植物，具有极高的药用价值。昆仑雪菊中的总黄酮含量高达12%，远超其他菊类。其富含的总黄酮具有多方面功效。其中，黄酮作为一种较强的抗氧化剂，其抗氧化能力是维生素E的10倍以上，可有效增强生物对病原体的抵抗能力，清除体内的氧自由基，从而起到阻止细胞衰老、癌变的作用。因此昆仑雪菊中富含的总黄酮具有免疫调节的功能，是调节血糖、降低血压血脂、抗衰老及癌变等有关药物中重要的物质。

目前，对于昆仑雪菊的植物分类学生物生态学特性等方面，国内外的研究开发报道较多，除此之外对其研究甚少，尤其是药理学方面，仅见其降血压、降血脂、抗氧化、微循环及抗凝血作用的研究。有关昆仑雪菊对肿瘤细胞影响的研究，目前鲜见报道。为进一步探讨昆仑雪菊中黄酮物质的抗肿瘤活性研究，首先从昆仑雪菊中提取总黄酮，进一步研究昆仑雪菊中总黄酮对肿瘤细胞增殖抑制作用，不仅为开发和综合利用昆仑雪菊资源提供一定的理论依据，更为中药治疗肿瘤疾病的新药奠定理论与实践基础。

1药物与仪器

昆仑雪菊（2015年10月采自新疆和田地区昆仑山区），紫外可见分光光度计，电子天平，电热恒温水浴锅，水循环真空泵，旋转蒸发器，芦丁标准品，亚硝酸钠，硝酸铝，乙醇，氢氧化钠等均为AR级。

2实验方法

2.1分离提取昆仑雪菊中的黄酮

乙醇回流提取液：用适量体积分数95%的乙醇浸泡昆仑雪菊粉末48h，将抽滤所得液体在温度45℃条件下，用旋转蒸发仪蒸发4h，提取液转移到250ml容量瓶中，并定容到刻度，再取10ml溶液置50ml容量瓶中定容至刻度液。

2.2昆仑雪菊提取液的纯化

取15g大孔树脂，用95%乙醇浸泡24h。取10g大孔树脂装柱，用95%乙醇冲洗，冲洗至冲洗液与蒸馏水以1：4混合不显白色浑浊为止。将冲洗好的大孔树脂倒入昆仑雪菊粗提物中，摇床震荡24h。将震荡好的粗提物进行抽滤，上层固体用95%乙醇浸泡24h，下层液体密封冷藏备用。次日将浸泡好的固体进行抽滤，抽滤所得下层液体在45℃条件下旋蒸1.5h，所得粘稠液体经称量为9.13g，冷藏备用。测得总黄酮含量为68.04%。

2.3芦丁标准溶液的制备

（一）对照品溶液的制备

精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品50mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇35mL，置水浴上微热使其溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密吸取5mL，置于50mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得（每1mL中含有无水芦丁0.1mg）。

（二）标准曲线的制备

分别按照0.0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml浓度梯度量取对照品溶液（0.1mg/ml），并置于10ml容量瓶，各加30%乙醇使成5.0ml，各精密加入5%亚硝酸钠溶液0.3ml，充分摇匀，放置8分钟。各精密加入10%硝酸铝溶液0.3ml，充分摇匀，放置8分钟。各加lmol/L氢氧化钠溶液4.0ml，用蒸馏水稀释至刻度，充分摇匀，放置16分钟，用分光光度计，在510nm波长处测定其吸光度。分别以浓度、吸光度为横、纵坐标，绘制标准曲线图。

2.4提取液中总黄酮含量的测定

量取不同提取液100ml置于25ml容量瓶，加水至6ml，以相应溶液为空白对照组，根据以上方法配制样品溶液，在510nm波长处测定A值。代入回归方程后得出结果，见表1。

2.5 MTT法测定黄酮对肿瘤细胞活性的影响

采用MTT法检测样品对MCF7细胞增殖的抑制作用。将MCF7细胞分别以3x104个/ml接种于96孔培养板中，加入培养液，在37℃饱和湿度、5%C02条件下孵育24h，24h后观察细胞贴壁的情况。取出每孔的培养液，按照梯度浓度0、25、50、100、200、400、600μg/ml向每组各孔中加入昆仑雪菊提取液的培养溶液，同时向对照组加入相同浓度得DMSO，阳性对照组每组为4个孔，向每孔加入顺铂（20g/μl），在37℃饱和湿度、5%C02条件下孵育48、72、96h，在培养结束4h前，向每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl，继续培养4h，吸去孔中的上清液，向每孔加入DMS0150μl，置于摇床上低速振荡，在结晶物充分溶解后，用DNM-9602G型酶联免疫检测仪（OD510nm）测每孔的吸光度值，由公式可得细胞增值抑制率，抑制率=1-（实验组A值一空白组A值）/（对照组A值一空白组A值），抑制率≥30%判定药物敏感试验为阳性，抑制率≤30%判定药物敏感试验为阴性。

3结果与分析

按照浓度梯度0、25、50、100、200、400、600μg/ml，将不同浓度的昆仑雪菊提取液作用于MCF7细胞，孵育72h后，观察不同浓度的昆仑雪菊提取液样品对MCF7细胞增殖的影响，并记录数据。由表2知，昆仑雪菊总黄酮粗提物对MCF7细胞有抑制作用，其IC50为372.59μg/ml，增大浓度，细胞增殖的抑制率也随之增大，因此昆仑雪菊总黄酮粗提物对MCF7细胞生长抑制影响呈剂量依赖性。通过与提取物的IC50比较，昆仑雪菊总黄酮的纯化物对MCF7细胞增值具有抑制作用。

4结论与讨论

由于目前主流的治疗癌症方法的缺陷很大，因此国内外科学家们开始将研究抗肿瘤药物的目光移至天然产物上，其中包括从中草药中提取抗肿瘤活性强的物质。本研究中，用乙醇回流提取法提取昆仑雪菊黄酮类化合物。利用可见紫外分光光度法对昆仑雪菊药材中总黄酮的含量进行测定。选用芦丁为对照品，选择测定波长510nm，制作标准曲线和回归方程，再通过样品吸收度值计算含量结果发现，昆雪菊总黄酮在浓度为0.01～0.08mg/mmL的范围内具有良好的线性关系。

该研究采用MTT法检测昆仑雪菊总黄酮粗提取物对细胞增殖的影响。由最终结果可得，昆仑雪菊总黄酮粗提物对MCF7细胞增值具有抑制作用。活细胞比例随样品浓度加大逐渐减少，细胞凋亡发生率明显上升。综上，昆仑雪菊总黄酮纯化物对MCF7细胞有很好的抑制作用，其机制可能与其诱导细胞有关。

本课题研究昆仑雪菊中总黄酮对肿瘤细胞活性抑制作用，在以后的研究中，还应就具体增值抑制作用机理展开具体研究。