CD44V6和 RAB5a在结肠癌中的表达及相关性研究

陈福军,于海涛,赵 斌,辛国荣,张立海,王 宇,刘 洋

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

结直肠癌是最常见的消化道肿瘤。据统计,结直肠癌的死亡率占每年恶性肿瘤总死亡率的10%左右,连续5年排在第3位。在每年新发癌症患者中 ,结直肠癌同样以10%左右的发生率牢牢占据前3位。结肠癌的发病年龄呈年轻化趋势,术后转移率、复发率逐年升高,已经引起疾病控制部门和临床医生的高度重视。结肠癌的局部浸润和淋巴转移都在早期发生。因临床症状发生较晚、表现不典型及检查手段的局限性,使结肠癌的早期诊断愈加困难,客观上给结肠癌的浸润、转移提供了时间。恶性肿瘤的浸润、转移过程是由多因素参与的复杂过程,涉及细胞游走、定植、增殖、新生血管形成、免疫监视等多个方面,目前还没有确切的手段可以对这个过程进行监测和控制。因此,本项目对 CD44V6和 RAB5a在结肠癌中的表达及相关性研究,为结肠癌的早期诊断提供科学依据。

1 实验材料

1.1 标本收集

选取2010— 12～ 2011— 12在佳木斯大学附属第一医院外科接受治疗的60例原发性结肠癌患者,其中男 30例,女30例 ,正常结直肠组织 20例,患者年龄 36～ 79岁 ,平均 56.8岁。术前均未接受放、化疗及抗肿瘤药物治疗,所选取的标本均为手术切除的新鲜组织。

1.2 主要仪器

WMK-08型电热恒温鼓风干燥箱(山东);YL-3A回转式切片机 (上海 );HI1220摊片机、烘片机(上海);Olympus BX51型电子显微镜(日本);HH-W21-600型电热恒温水浴箱(上海);Socorex可调式加样器(瑞士)。

1.3 主要试剂

鼠抗人 RAB5a单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司 );鼠抗人 CD44V6单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司);SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司);0.01M枸椽酸缓冲液;0.01MPBS缓冲液(pH7.2～ 7.4)。

2 实验方法

2.1 免疫组化实验

将手术切除后的结肠癌以及癌旁组织标本置于4%中性甲醛溶液中固定,常规石蜡包埋后连续切片、采用免疫组化法 (SP法)检测 CD44V6和 RAB5a的表达情况、实验步骤严格按照说明书进行、抗原修复采用微波热修复方法。

2.2 实验结果判定

每例切片选择 8个高倍视野,按照 CD44V6和 RAB5a阳性细胞数占视野中总细胞数的百分比分为3级:无阳性着色或阳性细胞数 ＜10%为阴性(一);阳性细胞数在10%～ 50%之间为阳性(+);阳性细胞数＞50%为强阳性(++ )。以每例切片上相对正常的组织作为阳性对照。只有明显胞膜或胞浆染色的细胞判定为正常染色,如染色不连续,明显减弱或缺失则被评定为不正常染色。

2.3 统计学处理

采用 SPSS16.0统计软件包分析两独立样本率的差异及配对资料率的相关性,用i2检验,P＜0.05为差异有显著性。

3 实验结果

3.1 CD44V6和 RAB5a在结肠癌中的表达

CD44V6阳性表达呈棕黄色细颗粒状均匀分布,主要位于细胞质中。CD44V 6在正常细胞中低表达。RAB5a蛋白阳性表达呈棕黄色细颗粒状均匀分布,主要位于细胞膜和细胞质中。RAB5a在正常细胞中低表达。见表1。

表1 CD44V6和 RAB5a在结肠癌、癌旁组织及正常组织的表达

3.2CD44V6和 RAB5a蛋白在结肠癌中表达的相关性研究

本实验发现在结肠癌组织中 CD44V6与 RAB5a的表达呈正相关 (rs=0.410,P＜0.05),即随着 CD44V 6表达的增加 RAB5a的表达也相应的增加,差异有统计学意义,见表2。

表2 CD44V6和 RAB5a蛋白在结肠癌中表达的相关性

4 讨论

CD44蛋白是一种未分类的黏附分子,机体可以通过CD44蛋白受体识别透明质酸和胶原蛋白。近年研究发现,CD44参与多种肿瘤的侵袭和转移过程。CD44V6是科学家Herrtich在研究一些分化不良的息肉中检测以 V 6外显子发现上的,由于其在肿瘤浸润中有增强的高频率表达,从而推测表达 CD44V6的肿瘤细胞能够有利于癌细胞浸润和转移的条件[1～3]。本实验研究发现 CD44V6在结肠癌中表达阳性率明显高于正常组织及癌旁组。CD44V6的表达与结肠癌的分化程度、淋巴结转移等情况有关。CD44V6促进转移的机理可能是它可使癌细胞获得转移能力,通过与远隔血管和淋巴管内某些配体结合,使转移至那里的癌细胞更稳定的寄居,形成转移癌灶。RAB5蛋白为 RAB家族成员之一 ,它的主要功能是细胞内囊泡运输的调控因子,RAB5蛋白结合 GTP时表现出 GTP酶的活性,包括 RAB5a、RAB5b和 RAB5c。哈尔滨医科大学李钰等人首次发现 RAB5A蛋白可能与肿瘤转移相关[4,5]。试验研究发现 RAB5a表达程度随着结肠癌分化程度的降低而明显增高,与结肠癌患者的年龄、性别、部位无关。不同分化程度结肠癌组织 RAB5a的表达程度差异有显著性,RAB5a表达程度随着淋巴结转移、Dukes分期期别升高而明显升高,与局部浸润无明显关系。本实验结果提示CD44V6和 RAB5a的表达对结肠癌的较早的浸润和转移以及不良预后有参考价值 CD44V6和 RAB5a的高表达与宫颈癌的浸润和转移密切相关有可能成为判断结肠癌侵袭和转移的有价值的指标联合检测两种指标可作为早期筛查和诊断的标志。

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