西仑吉肽的合成制备

孔　毅，黄　海，赖伊丽，黄世龙，刘会敏

(中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 210009)

西仑吉肽(cilengitide，EMD- 121974)是德国化学家Kessler设计的含有RGD序列的环肽c[RGDf(N-Me)V]。该肽基于体内αvβ3整合素配体，通过综合运用环化、空间筛选和甲基化扫描而得,对αvβ3整合素具有高亲和性和选择性[1]。临床试验表明，该肽不仅能较好抑制黑色素瘤和胶质细胞瘤生长，而且与放射治疗配合能提高其他肿瘤如头颈鳞状细胞瘤的治愈率[2]，具有较好的市场前景和潜力。

除西仑吉肽发明者提供合成方法外[1]，目前尚未见西仑吉肽合成工艺细节研究的报道。本研究尝试对西仑吉肽合成方法进行优化，采用Fmoc固相合成与液相合成相结合的方法，以HBTU，PyBOP/HOBt为缩合剂，对合成方法特别是难以缩合的氨基酸的缩合方法进行了研究，对环化条件进行了探索。本方法合成效率高、原料易得、路线简单易行、具有一定的工业化应用前景。

图1　西仑吉肽分子结构式[1]Fig.1　The molecular structure of cilengitide[1]

1　材料与方法

1.1　仪器与设备

砂芯玻璃管，4号砂芯；循环水式真空泵，予华SHZ-DⅢ，河南巩义予华仪器有限公司；紫外-可见分光光度计，752，上海菁华科技仪器有限公司；半制备型高效液相色谱仪，BioLogic DuoFlow Pathfinder 20/80 System，美国Bio-RAD；高效液相色谱仪，岛津20A；冻干机，Labconco；质谱仪，岛津2010MS。

1.2　材料与试剂

2-CTC树脂，载量为0.9 mmol/g；9-芴甲氧基羰基(Fmoc)-氨基酸[Fmoc-Arg(Mtr)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-(Otbu-)Asp-OH；Fmoc-D-Phe-OH；Fmoc-(N-Me-)Val-OH]；苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)；六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)；1-羟基苯丙三氮唑(HOBT)；N, N-二异丙基乙胺(DIEA) ；乙二硫醇(EDT)；三异丙基硅烷(TIS)，均为上海吉尔生化公司产品。二氯甲烷(DCM)；无水甲醇；无水乙醇；无水乙醚；三氟乙酸(TFA)；六氢吡啶(哌啶，PIP)；N, N-二甲基甲酰胺(DMF)；茚三酮；均为国产分析纯。乙腈，美国TEDIA，色谱纯；纯净水，乐百氏牌。

1.3　方法

1.3.1树脂溶胀

称取2 g 2-CTC树脂于烧杯中，用20 mL DMF浸泡30 min后倒出约一半体积DMF，加入10 mL DCM浸泡30 min，用DMF洗涤树脂2～3次后，用真空泵将树脂抽滤干。

1.3.2线性肽的合成

1)首个氨基酸上载：称取Fmoc-Arg(Mtr)-OH 4.16 g溶于10 mLDMF，再加入DIEA 2 mL，溶解完全后与树脂混合均匀，通氮气室温25 ℃下搅拌反应2 h；取少量于EP管中，加20%(体积比)PIP/DMF脱保护5 min，茚三酮法(Kaiser法)[3]定性检测反应进行的程度，判断各步接肽的终点，反应结束后，加入2 mL甲醇，继续反应0.5 h后，抽滤掉反应液后。以DMF洗涤2次后，再以DMF，无水甲醇交替洗涤2次。真空干燥称重测肽树脂担载率，mmol/g。

2)脱保护：加入30 mL 20%PIP/DMF浸没肽树脂，氮气搅拌，分别经过5和15 min的2次脱保护后，茚三酮法检测，反应完全后抽滤掉反应液，DMF洗涤树脂3～4次，抽干。

3)上载下一个氨基酸：称取Fmoc-(N-Me-)Val-OH 1.20 g 溶于适量DMF，再加入HBTU 1.29 g，HOBt 0.5 g，DIEA 1 mL溶解完全后与肽树脂混合均匀，通氮气室温25 ℃下搅拌反应2 h；茚三酮法检测，反应完全后抽滤掉反应液，DMF洗涤3～4次。Fmoc-(N-Me-)Val-OH为困难氨基酸，单纯使用HBTU不能完全缩合，尝试改用缩合剂PyBOP和延长反应时间来完成缩合。

4)上载其他3个氨基酸：重复2)和3)，把剩下的Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-(Otbu-)Asp-OH和Fmoc-Gly-OH依次接到肽树脂上。

1.3.3Fmoc法[4]测定连接效率

称取Fmoc-Gly-OH(相对分子质量：339.4)5 mg置于小玻璃瓶，加1 mL体积分数为20%的PIP/DMF，脱保护30 min，无水甲醇定容至100 mL；再稀释10倍后， 依次取1、2、3、5、6 和 7 mL置于10 mL容量瓶中，无水甲醇定容，分别与空白即体积分数为20%的PIP/DMF对照，测301 nm的紫外吸收值。利用标准曲线计算肽树脂的缩合效率。

1.3.4肽树脂切割与肽沉淀

在树脂上将线性肽合成完成后，用DMF洗涤3次，甲醇洗涤1次，DMF 洗涤1次，甲醇洗涤1次后真空干燥后，称重，按1 g肽树脂5 mL裂解液TFA/DMF(体积比5∶95)的比例加入裂解液，冰浴搅拌反应2 h。然后将裂解液抽滤，并用少量裂解液冲洗树脂2～3次，冲洗液和裂解液收集到一起。加无水乙醚沉淀得到线性肽粗品，HPLC/MS分析。

1.3.5环肽的合成

线性肽粗品0.85 g溶解于2 000 mL DCM中，加入PyBOP 1.52 g，HOBt 0.4 g，和DIEA 1.2 mL，冰浴搅拌反应24 h。将反应液减压旋蒸至约20 mL。分别用10%HCl/H2O(体积比)，饱和NaHCO3，饱和NaCl依次萃取后，加入等体积裂解液TFA∶TIS∶EDT∶H2O为95∶2∶2∶1冰浴反应2 h。无水乙醚沉淀得环肽粗品。

1.3.6环肽的分离纯化和鉴定

用高效液相色谱(HPLC)分析环肽粗品，液相色谱条件: Kromasil C18(4.6 mm×250 mm) 色谱柱; 波长λ为214 nm; 流动相，A为纯净水∶乙腈∶TFA为90.0∶10.0∶0.1 (体积比)， B为乙腈∶纯净水∶TFA为90.0∶10.0∶0.1 (体积比)；进样量10 μL; 流速1 mL/min。经MS分析确定主峰与目标肽相对分子质量一致后，用制备型高效液相色谱(HPLC)纯化环肽粗品后，冷冻干燥。纯化后的环肽用分析HPLC检测纯度，并用质谱与核磁共振研究其结构。

2　结果与分析

2.1　树脂的选择

选择2-CTC树脂(分子式见图2, P表示树脂珠)，因为一方面，与其他树脂相比，2-CTC树脂具有很强的活性；氨基酸羧基端与2-CTC树脂的反应为取代反应，是不可逆反应。另一方面，由于2-CTC树脂反应位点附近位阻较大，大大减少了二肽时由于分子内环化生成哌嗪二酮(DKP)[5]的可能性。

图2　二氯树脂Fig.2　2-CTC resin

2.2　接肽反应

普通氨基酸用HBTU的缩合效率达到95%以上；N-甲基氨基酸属于困难氨基酸，其反应活性很低，为提高共缩合效率，分别考察HBTU和PyBOP在不同时间2，4，6，8，10 h的缩合效率，结果如图3。

图3　HBTU和PyBOP反应进度图Fig.3　The extent of reaction with HBTU & PyBOP

确定8 h为最适宜反应时间后，考虑到HBTU有一定的缩合效率，而PyBOP虽然缩合效率高但价格较贵，于是采用HBTU和PyBOP以一定比例混合使用，分别以HBTU∶PyBOP(体积比)为1∶2，1∶1，2∶1，3∶1考察缩合效率，试验结果显示2∶1为最适宜配比。

2.3　α-氨基保护集基团的脱除

在每一步接肽反应完成后， 下一个氨基酸接入之前， 需要除去保护基团。本次试验采用的是PIP/DMF的溶液，基团的脱除效果与哌啶的含量及其脱除时间关系见图4。

图4　不同浓度哌啶Fmoc脱除率Fig.4　The Fmoc deprotection ratio of piperidine at different concentration

图4可以看出，随着哌啶浓度的增加，脱保护率增加且脱保护的时间缩短。使用20%浓度的保护试剂在10 min时脱保护效率可达99%。

2.4　线性肽粗品HPLC和MS结果分析

线性肽粗品HPLC和MS分析结果见图5和图6。色谱条件：流动相A为乙腈/水(10%，含0.1 %TFA ，体积分数，下同)，B为乙腈/水(90%，含0.1% TFA)，梯度洗脱0～30 min，20%～40% B。紫外检测器，波长范围为214 nm；色谱柱为Kromasil C18，规格为4.6×250 mm，流速为0.2 mL/min。样品进样量为10 μL 。

质谱条件：离子检测方式SCAN，离子极性正离子，离子化方式为电喷雾离子化，检测电压1.5 kV，雾化气体流速1.5 L/min；曲线脱溶剂装置(CDL)温度250 ℃，加热块(block)温度200 ℃。

图5　线性肽粗品HPLC图Fig.5　The HPLC of the crude linear cilengitide

图6　线性肽粗品主峰质谱图Fig.6　The MS of the crude linear cilengitide

2.5　环化方法的选择

一般环肽按照成环所含键分为2类：全部为酰胺键的均环肽为一类，除酰胺键外还有二硫键和醚键等的杂环肽为另一类。而按照桥连位置分的话，分为头尾相连环肽、头侧相连环肽、侧侧相连环肽。其中头尾相连合成难度最大，因为线性肽分子趋于能量较低的稳定形态，也就是舒展的状态。这样分子的反应位点，即两端的羧基和氨基空间相距较远，靠近的可能性较低，反应活性降低。

液相合成环肽，其中发生的反应主要是分子内的反应和分子间的反应。为了减少副反应分子间反应形成的多聚体，应该尽量将肽反应浓度降低，一般控制在10-3～10-4mol/L高度稀释的溶液里反应。常用的液相合成法有：活泼酯法、叠氮法、混合酸酐法、直接法、硫酯法和辅助成环法[6]。其中活泼酯法、叠氮法和混合酸酐法需要制备中间体，且需要低温反应。根据实际情况，最终确定使用直接法，反应浓度控制范围1×10-3～1×10-4mol/L，环化过程用HPLC检测至反初始应物峰消失。

2.6　环肽粗品的HPLC分析结果

沉淀后得白色环肽粗品560 mg，HPLC分析结果如图7。

色谱条件：流动相A为乙腈/水(10%，含0.1%TFA，体积分数，下同)，B为乙腈/水(90%，含0.1% TFA) ，梯度洗脱为0～30 min，10%～100% B，紫外检测器，波长范围为214 nm；色谱柱为反相C18，规格为4.6×250 mm，流速为0.2 mL/min。样品进样量为10 μL 。

图7　环肽粗品HPLC图Fig.7　The HPLC of the crude cilengitide

2.7　环肽纯化后的HPLC、MS和NMR分析结果

目标峰液体真空冷冻干燥得到189 mg 西仑吉肽，在粗品中质量分数为33.8%；西仑吉肽纯度为98.3%，总产率为28.2%(以首个氨基酸上载量1.14 mmol记)。

HPLC结果见图8，MS结果见图9。 NMR结果与文献报道的NMR图谱[11]一致。

图8　环肽纯化后HPLC图Fig.8　The HPLC of the purified cilengitide

图9　环肽纯化后质谱图Fig.9　The MS of the purified cilengitide

3　结论

本研究采用Fmoc固相法合成线性肽，然后采用液相法环化合成了西仑吉肽。合成中，解决了难以缩合氨基酸的缩合效率问题，合成了高纯度的线性肽；并选择合适的液相环化条件合成环肽。所合成环肽纯度为98.3%，相对分子质量与理论相对分子质量588相符，NMR图谱与文献报道一致，说明该方法合成的西仑吉肽结构正确。本方法合成效率高，原料易得，路线简单易行，具有一定的工业化应用前景。

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