抗氧化紫球藻胞外多糖酶解物制备工艺优化

董 乐 何静艳 郑婷婷 戴聪杰 黄卫红 李元跃

(1. 泉州师范学院海洋与食品学院，福建 泉州 362000；2. 泉州师范学院福建省海洋藻类活性物质制备与功能开发重点实验室，福建 泉州 362000；3. 泉州师范学院近海资源生物技术福建省高校重点实验室,福建 泉州 362000；4. 集美大学福建省海洋渔业资源与生态环境重点实验室，福建 集美 361000)

本课题组前期从非洲大蜗牛消化道中分离出一种混合酶，酶自身无抗氧化能力，但EPS经其酶解后产物的抗氧化能力显著提高。本研究拟以该混合酶为酶制剂，以羟自由基(·OH)清除率为综合评价指标，对EPS的酶解工艺进行优化，并评价EPS粗品酶解前后的抗氧化活性，以期为EPS在功能性食品和药品方面的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

紫球藻藻种：中国科学院海洋研究所藻种库；

非洲大蜗牛消化道中制备的混合酶：1 874.52 U/g，泉州师范学院福建省海洋藻类活性物质制备与功能开发重点实验室。

1.1.2 主要仪器设备

台式高速离心机：Allegra 64R型，美国贝克曼库尔特有限公司；

恒温水浴锅：HH-6D型，金坛市城东宏业实验仪器厂；

紫外可见分光光度计：UV-1200型，上海美谱达仪器有限公司；

冷冻干燥机：FDU-2110型，上海纪革森实业有限公司；

旋转蒸发仪：W2-100S型，上海申生科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 EPS粗品的提取 取紫球藻的KOCH培养液，4 000 r/min 离心20 min，留上清液，旋转蒸发浓缩(45 ℃)，加入3倍体积无水乙醇醇析过夜，4 000 r/min离心10 min，收集醇析物，真空冷冻干燥(-80 ℃，-5 Pa，48 h)，得EPS粗品。

1.2.2 酶解液的制备工艺 取一定量EPS粗品配成水溶液，依次调节酶解温度、酶解时间、酶解pH值、酶添加量(酶/底物)、保温酶解(不断调节pH 值，使酶解过程在初始pH 值下进行)一定时间后，沸水浴灭酶活10 min，10 000 r/min 离心10 min，得酶解液。

1.2.3 单因素试验 通过预试验确定酶解EPS粗品单因素试验的基本条件为：酶解温度65 ℃、酶解时间6 h、酶解pH值7.0以及酶添加量(酶/底物，E/S)2.8 U/mg。通过固定其他条件只改变其中一个条件来分析各单因素对酶解产物清除·OH能力的影响[14]。

(1) 酶解温度：酶解温度分别选取25，35，40，45，55，60，65，70，75 ℃，在酶解时间6 h，酶解pH值7.0，酶添加量2.8 U/mg 的条件下，测定EPS粗品酶解产物对·OH的清除率。

(2) 酶解时间：在酶解温度65 ℃，pH值7.0，酶添加量2.8 U/mg的条件下，分别酶解2，3，4，5，6，7 h，测定EPS粗品酶解产物对·OH的清除率。

(3) 酶解pH值：酶解pH分别选用4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，在酶解温度65 ℃，酶解时间6 h，酶添加量2.8 U/mg的条件下，测定EPS粗品酶解产物对·OH的清除率。

(4) 酶添加量：酶添加量分别选用0.1，0.7，1.4，2.0，2.8 U/mg，在酶解温度65 ℃，酶解时间6 h，pH值8.0的条件下，测定EPS粗品酶解产物对·OH的清除率。

1.2.4 Box-Behnken响应面优化试验 根据单因素试验结果，采用统计软件Design-Expert 8.0.6中Box-Behnken Design试验设计原理[15-16]，以·OH清除率为响应值，确定中心点试验是自变量取值为试验设计水平中值，非中心点试验为其他取值，重复5次中心点试验，以估计试验误差。

1.2.5 EPS粗品酶解产物的制备 以响应面最佳优化参数酶解EPS粗品得酶解液，10 000 r/min离心5 min，Sevage法除蛋白[17-18]后，4 000 r/min离心10 min，上清液旋转蒸发浓缩(45 ℃)，加入3倍体积无水乙醇醇析过夜，4 000 r/min离心10 min，收集醇析物，真空冷冻干燥(-80 ℃，-5 Pa，48 h)，得EPS酶解产物。

1.2.6 EPS粗品酶解前后抗氧化活性的测定

(1) ·OH清除能力：参考文献[14]。

(2) DPPH·清除能力：参考文献[19]。

(3) ABTS+·清除能力：参考文献[20]。

1.3 数据处理

所有试验至少重复3次，用Microsoft Excel进行数据整理，所得数据以均值±标准差表示。不同平均值之间的差异显著性检验采用SPSS 11.5统计软件中的邓肯氏多重比较法进行。显著差异水平P<0.05，极显著差异水平P<0.01。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶解温度 由图1可知， EPS粗品酶解产物对·OH的清除率随酶解温度的升高呈先上升后下降的趋势。当酶解温度升至65 ℃时，EPS粗品酶解产物对·OH的清除率达到最大值。酶解过程中，酶催化反应的速度和酶的稳定性会受到温度的影响。随着温度的升高，反应速度会加快，但温度过高会导致酶失活以及变性，从而影响反应速度。因此，最佳酶解温度选取65 ℃。

图1 酶解温度对EPS粗品酶解产物·OH清除 能力的影响

Figure 1 Effect of enzymolysis temperature on hydroxyl radical scavenging activity of the enzymatic hydrolysates

2.1.2 酶解时间 由图2可知， EPS粗品酶解产物对·OH的清除率随酶解时间的延长先增大后减小，在6 h时达到最大值。酶解时间大于6 h后，由于大部分EPS粗品已被酶解，且酶活力逐渐下降，酶解产物不再随时间的延长而增加，酶解产物对·OH的清除率开始下降。因此，酶解时间选取6 h为宜。

图2 酶解时间对EPS粗品酶解产物·OH清除 能力的影响

Figure 2 Effect of enzymolysis time on hydroxyl radical scavenging activity of the enzymatic hydrolysates

2.1.3 酶解pH 由图3可知，酶解体系中pH对酶解效果有显著的影响。当酶解pH在4.0～8.0时，随pH的升高EPS粗品酶解产物对·OH的清除率急剧增大，pH 8.0时达到最大值，随后快速下降。这是因为不同的酶对应不同的最适pH，过酸过碱都会使酶失活。所以酶解pH选择8.0。

图3 酶解pH对EPS粗品酶解产物·OH清除 能力的影响

Figure 3 Effect of enzymolysis pH on hydroxyl radical scavenging activity of the enzymatic hydrolysates

2.1.4 酶添加量 由图4可知，EPS粗品酶解产物对·OH的清除率随酶添加量的增加逐渐增加，可能是酶量的增加而可提高其水解能力，从而使酶解产物中对·OH清除活性强的组分增加。但考虑到试验条件的可控制性和重现性，酶添加量选择2.8 U/mg为佳。

2.2 Box-Behnken响应面试验

在单因素试验的基础上，利用响应面分析法对EPS粗品酶解工艺条件进行优化，因素水平见表1。

利用软件Design-Expert 8.0.6对试验结果(表2)进行多元回归拟合，得数学回归模型：

图4 酶添加量对EPS粗品酶解产物·OH清除 能力的影响

Figure 4 Effect of enzyme-to-substrate ratio on hydroxyl radical scavenging activity of the enzymatic hydrolysates

表1 Box-Behnken设计试验因素水平编码Table 1 Factors, levels and codingTable of Box-Behnken design test

Y=62.27+2.18A+3.25B+1.51C+9.31D+0.78AB-2.92AC+1.73AD-3.48BC+1.02BD+0.36CD-2.15A2-7.31B2-6.31C2-4.76D2。

(1)

对结果进行统计分析，结果见表 3。

由表3可知，该模型P值<0.000 1，表明模型是极显著的，而且失拟项P值为0.154 2，表明失拟项不显著，该模型稳定。由表3中回归系数的显著性检验可知，A、B和D对EPS粗品酶解产物的·OH清除率影响极显著(P<0.01)，C对EPS粗品酶解产物的·OH清除率影响显著(P<0.05)；AC和BC对EPS粗品酶解产物的·OH清除率影响均显著(P<0.05)，A2对EPS粗品酶解产物的·OH清除率影响显著(P<0.05)，B2、C2和D2对EPS粗品酶解产物的·OH清除率影响极显著(P<0.01)。

将不显著项从回归方程中剔除，进行二次方差分析，结果见表 4。结果表明，回归方程中各项均达显著水平，失拟项不显著(P>0.05)。回归方程为：

Y=62.27+2.18A+3.25B+1.51C+9.31D-2.92AC-3.48BC-2.15A2-7.31B2-6.31C2-4.76D2。

(2)

响应面中的等高图能够直观地反映出各因素交互作用对响应值的影响，酶解温度和酶解pH、酶解时间和酶解pH之间交互作用的等高线图和响应面见图5、6。

酶解温度和酶解pH对EPS粗品酶解产物的·OH清除率的影响近似椭圆形，说明有交互作用[图5(b)]。由图5(a)可知，当酶解温度一定时，EPS粗品酶解产物对·OH清除率随pH的增加呈先增加后减小的趋势，在pH为7.0～7.8 时，EPS粗品酶解产物的·OH清除率较高，在pH一定时，EPS粗品酶解产物对·OH清除率随酶解温度的变化较小，当酶解温度为65 ℃左右时，EPS粗品酶解产物的·OH清除率较高。

酶解时间和酶解pH对EPS粗品酶解产物的·OH清除率的影响近似椭圆形，说明有交互作用[图6(b)]。由图6(a)可知，当酶解pH一定时，EPS粗品酶解产物的·OH清除率随时间的延长呈先增加后减小的趋势，在酶解时间达6 h时，EPS粗品酶解产物的·OH清除率较高，在酶解时间一定时，EPS粗品酶解产物的·OH清除率随pH的增加有较小幅度的变动，在酶解pH 7.0～7.8时，EPS粗品酶解产物的·OH清除率高。

表2 试验设计及结果Table 2 Experimental design and results

表3 回归方程显著性检验和方差分析†Table 3 Analysis of variance and significance test of regression equation

† *表示差异显著，P<0.05；**表示差异极其显著，P<0.01；R2=0.959 3，Adj.R2=0.918 6。

表4 二次方差分析†Table 4 Quadratic analysis of variance

† *表示差异显著，P<0.05；**表示差异极其显著，P<0.01；R2=0.949 7，Adj.R2=0.921 8。

图5 酶解温度和酶解pH对·OH清除率影响的响应曲面和等高线图Figure 5 Response surface plot and contour plot for effects of enzymolysis temperature and pHand their mutual interaction on hydroxyl radical scavenging

图6 酶解时间和酶解pH对·OH清除率影响的响应曲面和等高线图Figure 6 Response surface plot and contour plot for effects of enzymolysis time and pHand their mutual interaction on hydroxyl radical scavenging

2.3 验证实验

根据Design-Expert 8.0.6软件计算出的最优工艺条件：酶解温度63 ℃、酶解pH 8.0、酶添加量2.7 U/mg，酶解时间6.3 h。按该条件进行3次平行实验，实际测定EPS粗品酶解产物对·OH的清除率为(70.64±0.38)%，理论预测值为67.78%，两者非常接近，表明模型预测值与实际值的误差在允许范围之内。说明采用响应面法优化得到的EPS粗品酶解工艺条件参数是可信的。

2.4 EPS粗品酶解前后的抗氧化活性

3 结论

本研究以从非洲大蜗牛消化道中分离的混合酶为酶制剂，通过响应面法建立EPS粗品酶解制备抗氧化酶解物工艺的二次多项回归方程，通过方差分析，模型显著，所得方程拟合度高。试验结果表明，最优酶解工艺条件为：酶解温度63 ℃、酶解时间6.3 h、酶解pH 8.0、酶添加量2.7 U/mg，在此条件下EPS酶解产物的·OH清除率为(70.64±0.38)%。

表5 EPS粗品酶解产物对自由基的清除效果Table 5 Effects of the enzymolysis EPS on radical scavenging