分化抑制因子Id3在散发性大肠腺癌中的表达及其与淋巴结转移的关系

马艳会，刘揆亮，刘 红，王沧海，张 颖，吴 静

碱性螺旋-环-螺旋 (bHLH)转录调控因子是细胞生长过程中重要的调控因子，具有调节细胞周期、细胞分化等作用。分化抑制因子 (inhibitor of DNA binding/differentiation，Id)蛋白家族包括Id1、Id2、Id3、Id4，属于HLH蛋白家族，因缺乏与DNA结合区域而对HLH转录因子起负性调节作用，具有调控细胞定向分化、促进肿瘤细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进血管形成及肿瘤浸润等作用［1］。Id蛋白家族成员具有相互重叠的作用，同时也有各自独特的生物学作用。Id1在肿瘤中发挥的生物学作用已得到普遍认可，但目前国内关于Id3蛋白对消化道肿瘤尤其是大肠肿瘤发生、发展的报道较少，因此本研究采用免疫组织化学二步法 (EnVision System)检测Id3在正常大肠黏膜组织、大肠腺瘤及散发性大肠腺癌中的表达，分析其与各临床病理特征的相关性，探讨Id3在人散发性大肠腺癌发生、发展中的作用及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料收集 首都医科大学附属北京世纪坛医院2009年1月—2010年1月临床资料完整且保存完好的18例患者的正常大肠黏膜组织，30例患者的大肠腺瘤组织，35例患者的散发性大肠腺癌石蜡标本，患者年龄28～73岁，平均48.5岁。患者术前均未进行放化疗及生物免疫治疗。

1.2 方法 检测采用EnVision System，试剂盒购自丹麦DAKO公司，操作步骤严格按照说明进行。兔抗人Id3单克隆抗体 (浓缩型)购自abcam(英国)，产品编号ab41834。所有标本经苏木紫-伊红 (Hematoxylin-eosin，HE)染色观察再次证实其病理性质，PBS代替一抗做阴性对照。由两位经验丰富的病理学医师双盲读片，结果取平均值。

1.3 免疫组织化学结果观察及判断标准 对Id3蛋白染色片进行半定量分析，分值A为染色评分:无着色计0分，浅棕黄色计1分，棕黄色计2分，深棕黄色计3分;同时随机选择5个高倍镜视野，计数癌细胞总数和阳性细胞个数，得出细胞阳性率，为分值B，＜10%计0分，10% ～25%计1分，26%～50%计2分，51% ～75%计3分，＞75%计4分。分值A与分值B之和即为该肿瘤细胞的染色指数评分，0～2分定义为阴性表达，3～7分定义为阳性表达。

1.4 统计学方法 应用SPSS 11.0统计软件包进行分析，采用多个独立样本Kruskal-Wallis Test检验，计数资料及关联性分析采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Id3在正常大肠黏膜、大肠腺瘤及散发性大肠腺癌组织中的表达 Id3在正常大肠组织中弱表达甚至不表达 (见图1)，在大肠腺瘤组织中主要表达于细胞核 (见图2)，而在散发性大肠腺癌组织中除在肿瘤细胞核中偶有表达外，主要在胞质中表达 (见图3)。Id3在正常大肠黏膜、大肠腺瘤、散发性大肠腺癌组织的阳性率分别为11.1%，70.0%和88.5%，3种组织中阳性率比较，差异有统计学意义 (χ2=20.66，P＜0.01)。

2.2 散发性大肠腺癌中Id3表达与临床病理特征的关系 Id3与患者性别，年龄，肿瘤浸润深度、分化程度、大小均无明显相关性 (P＞0.05)，与淋巴结转移有相关性 (P＜0.01，见表1)。

图1 Id3在正常肠黏膜的表达 (免疫组化，×200倍)Figure 1 The expression of Id3 in normal mucosa

图2 Id3在大肠腺瘤的阳性表达 (免疫组化，×200倍)Figure 2 The positive expression of Id3 in colonrectal adenoma

图3 Id3在大肠腺癌的表达 (免疫组化，×200倍)Figure 3 The positive expression of Id3 in colonrectal cancer

3 讨论

大肠癌是世界三大最常见肿瘤之一，早期结直肠癌的术后5年生存率为91%，但只有39%的大肠癌患者能够在早期阶段得到诊断和治疗。大肠癌发生淋巴结转移甚至临近器官转移其术后5年生存率降低为70%，发生远处转移其5年生存率则为11%［2］。因此早期诊断大肠癌对于患者预后起着至关重要的作用。大肠腺瘤是公认的癌前病变之一，腺瘤发展为腺癌的过程被称为结直肠腺瘤-癌序列，其涉及癌基因、抑癌基因以及其他转录调控因子的调控。分化抑制因子 Id3，即HLH462，由Christy等［3］在小鼠成纤维细胞系中发现。其后相继报道Id3在正常组织中不表达，在成熟细胞和静止细胞中低表达，高表达于增殖性细胞。Id3在多种恶性肿瘤如非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌等高表达［4-6］。体外实验表明，Id3-CCR6通路在B细胞介导的防止早期动脉粥样硬化的保护作用中发挥着非常重要的作用［7］。Id3通过调节人视网膜瘤易感基因 (retinblastoma，Rb)和E26转化特异性家族转录因子(Ets)调控肿瘤细胞的生长，同样受骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)、肿瘤转化生长因子 (transforming growth factor beta，TGF-beta)、表皮生长因子受体-蛋白激酶B-Smad蛋白 (EGFR-AKT-Smad)等多种信号转导途径调控［8-10］。

表1 Id3在大肠腺癌中的表达及其与临床病理特征的关系Table 1 Expression of Id3 in colonrectal cancer and its correlation with clinicopathological features

本研究采用免疫组织化学方法检测到Id3在正常大肠黏膜组织中弱表达，与Coppe等［11］报道一致。大肠腺瘤组织中Id3有较高的表达，与Wilson等［12］研究提示人大肠腺瘤中无Id的表达的观点不同，可能与种族差异、实验试剂及判断标准不同有关。不同的试剂盒可能会对实验结果产生一定的影响，且免疫组织化学作为半定量实验方法，其结果受实验者主观判断的影响。Id1在肠上皮细胞表达，导致转基因鼠的后代发生腺瘤，Id1和Id3在功能上有很多的相似之处，体外实验报道转染Id3基因呈现G2期和S期细胞明显增加，促进肿瘤的发生［13］。结合本研究结果，笔者推测Id3在大肠腺瘤中的较高水平表达与其促进细胞增殖、抑制细胞凋亡及分化的原癌基因的生物学特性有关，其可能参与腺瘤的发生、发展，进而促进大肠腺瘤恶性转化。本研究结果表明，Id3在散发性大肠腺癌中高表达，与国外报道相似［11］，其主要在细胞质中表达，也可见于细胞核中。有研究指出Id3细胞核阳性是肿瘤发生的促进因素［14］，因此细胞核中的表达较细胞质中的表达显得更有意义，这也许能够解释为什么Id3在大肠腺瘤中主要为细胞核阳性，而在散发性大肠腺癌中为细胞核和 (或)细胞质阳性。因此，笔者认为Id3参与了大肠腺癌发生。

一般情况下，侵袭与转移是恶性肿瘤的主要生物学特征，是影响肿瘤患者预后的重要因素。淋巴结远处转移是大肠癌患者的主要死亡原因，淋巴结转移也是术后辅助治疗的重要依据，因此了解肿瘤患者淋巴结转移情况尤为重要。Id3表达于成熟淋巴细胞，参与淋巴细胞功能的正常发挥，在淋巴系祖细胞中表达的Id3能够促进淋巴细胞成熟。研究发现Id3-/-基因敲除的小鼠存在体液免疫缺陷，B淋巴细胞增生缺陷和胸腺细胞成熟受限［15-16］。有报道指出将胃癌细胞中Id3基因敲除后癌灶变小，淋巴结转移数目减少，肿瘤细胞增殖和迁移能力下降，并且Id3是胃癌患者预后的独立指标［17-18］。本研究结果显示，Id3与淋巴结转移有关，在大肠肿瘤淋巴转移过程中起促进作用。因此Id3可能是判断大肠癌淋巴转移的一个潜在的重要指标，Id3高表达可能是大肠癌恶性程度的标志物。但本研究只运用了免疫组织化学技术进行检测，存在一定的局限性，是否可预示大肠癌患者的预后还需要一步的研究和证实。Id3在大肠正常黏膜组织中弱表达，在散发性大肠腺癌中高表达，表明其可能成为肿瘤靶向治疗的目标基因。

1 Benezra R，Davis RL，Lockshon D，et al.The protein Id:a negative regulator of helix-loop-helix DNA binding proteins ［J］.Cell，1990，61(1):49-59.

2 American Cancer Society.Cancer Facts＆ Figures 2010 ［M］ .Atlanta:American Cancer Society，2010.

3 Christy BA，Sanders LK，Lau LF，et al.An Id-related helix-loophelix protein encoded by a growth factor-inducible gene［J］.Natl Acad，1991，88(5):1815-1819.

4 Lee SH，Hao E，Kiselvuk A，Shapiro J，et al.Id3/E47 axis mediates cell-cycle control in human pancreatic ducts and adenocarcinoma ［J］.Mol Cancer Res，2011，9(6):782-790.

5 Kamalian L，Forootan SS，Bao ZZ，et al.Inhibition of tumourigenicity of small cell lung cancer cells by suppressing Id3 expression ［J］.Int J Oncol，2010，37(3):595-603.

6 Asirvatham AJ，Carey JP，Chaudhary J.ID1- ，ID2- ，and ID3-regulated gene expression in E2A positive or negative prostate cancer cells［J］.Prostate，2007，67(13):1411-1420

7 Doran AC，Lipinski MJ，Oldham SN，et al.B-cell aortic homing and atheroprotection depend on Id3 ［J］.Circ Res，2012，110(1):e1-e12.

8 Hogg K，Etherington SL，Youg JM，et al.Inhibitor of differentiation(Id)genes are expressed in the steroidogenic cells of the ovine ovary and are differentially regulated by members of the transforming growth factor-beta family［J］.Endocorinology，2010，151(3):1247-1256.

9 Shepherd TG，Theriault BL，Nachtigal MW.Autocrine BMP4 signalling regulates ID3 proto-oncogene expression in human ovarian cancer cells［J］.Gene，2008，414(1-2):95-105.

10 Jin X，Yin J，Kim SH，et al.EGFR-AKT-Smad signaling promotes formation of glioma stem-like cells and tumor angiogenesis by ID3-driven cytokine induction ［J］.Cancer Res，2011，71(22):7125-7134.

11 Coppe JP，Smith AP，Desprez PY.Id proteins in epithelial cells［J］.Exp Cell Res，2003，285(1):131-145.

12 Wilson JW，Deed RW，Inoue T，et al.Expression of Id helix-loophelix proteins in colorectal adenocarcinoma correlates with p53 expression and mitotic index ［J］.Cancer Res，2001，61(24):8803-8810.

13 李晓军，汪萍，贾丽，等.Id3-EGFP融合基因表达载体的构建及其在人肺癌细胞A549中的表达［J］.中华检验医学杂志，2006，29(12):1111-1115.

14 Kamalian L，Gosney JR，Forootan SS，et al.Increased expression of Id family proteins in small cell lung cancer and its prognostic significance ［J］.Clin Cancer Res，2008，14(8):2318-2325.

15 Thal MA，Carvalho TL，He T，et al.Ebf1-mediated down-regulation of Id2 and Id3 is essential for specification of the B cell lineage［J］.Proc Natl Acad，2009，106(2):552-557.

16 Pan L，Sato S，Frederick JP，et al.Impaired immune responses and B-cell proliferation in mice lacking the Id3 gene ［J］.Mol Cell Biol，1999，19(9):5969-5980.

17 Tsuchiya T，Okaji Y，Tsuno NH，et al.Targeting Id1 and Id3 inhibits peritoneal metastasis of gastric cancer［J］.Cancer Sci，2005，96(11):784-790.

18 Yang HY，Liu HL，Liu GY，et al.Expression and prognostic values of Id-1 and Id-3 in gastric adenocarcinoma ［J］.J Surg Res，2011，167(2):258-266.