调节性树突状细胞对哮喘小鼠气道炎症及白介素12和IgE表达的影响

刘焕星，曹 平

哮喘是一种慢性呼吸系统疾病，它以加剧的气道炎症、气道高反应性及氧化应激为特点［1］。哮喘的发生与炎性细胞，包括嗜酸粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞和辅助性T细胞的浸润有关［2］。已有研究表明，2型辅助性T淋巴细胞通过产生细胞因子介导炎症的级联反应，包括嗜酸粒细胞的募集、IgE和活化氧的产生以及肥大细胞的激活，共同构成气道高反应性的必要递质［3－5］。建立机体对过敏原的特异性耐受，可抑制哮喘的发生与发展。

树突状细胞 (dendritic cells，DC)是专职的骨髓来源抗原提呈细胞，是一群异源性、异质性的细胞群体。尽管DC是在Steinman［6］研究免疫原性时发现的，这些细胞在维持免疫耐受方面同样发挥了重要作用［7］。新近提出的调节性树突状细胞 (regulatory dendritic cells，rDC)具有负向调节免疫反应的功能，在体内外诱导T细胞低反应性及耐受性。

我们前期的研究已经证实，肺脏基质细胞培养上清液可以诱导成熟树突状细胞 (mature dendritic cells，mDC)分化发育成一种rDC，其细胞形态学、免疫分子表型表达、细胞因子分泌都不同于mDC，缺乏活化T细胞的重要信号［8］。本实验利用这种rDC的致耐受能力，通过诱导小鼠过敏性哮喘模型，研究其对卵清蛋白 (OVA)激发的气道过敏性炎症的影响及白介素12(IL－12)、IgE表达的变化，探讨其在哮喘中的作用。

1 材料与方法

1.1 rDC的制备 简要的说用含重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (rmGM－CSF)(10 ng/ml)、重组小鼠细胞因子白介素4(rmIL－4)(1 ng/ml)的RPMI1640完全培养基与小鼠骨髓细胞共培养8 d，用CD11c磁珠阳性选择CD11c+细胞，脂多糖 (LPS) (1 ng/ml)刺激24 h使其成为mDC，然后用含有50%肺脏基质细胞培养的上清液作为完全培养基共培养1周，得到免疫表型为CD11clowIalowCD11bhigh的rDC［8］。

1.2 主要试剂及仪器 OVA、LPS等购自Sigma公司;IL－12、IgE ELISA试剂盒购自R＆D公司;rmIL－4、rmGM－CSF购自美国Peprotech公司;普通倒置光学显微镜 (Olympus IX70)，普通光学显微镜 (OlympusCH20)，BIO－RAD 680酶标仪，鱼跃牌超声雾化器。

1.3 哮喘小鼠模型的建立 除正常组小鼠外，其余各组均经如下处理诱导哮喘样症状:以首次注射OVA抗原当日为第0天 (Day0)计，于Day0和Day9分别予0.1%OVA的氢氧化铝〔Al(OH)3〕溶液 (0.1 ml/只)腹腔注射，进行初次致敏和加强致敏。Day14～20:连续7 d予2%OVA的0.9%氯化钠溶液进行雾化攻击，1次/d，30 min/次。抗原激发后观察小鼠反应，表现为呼吸加深加快，头面部瘙痒，安静少动，弓背，二便失禁为阳性反应，表明哮喘模型建立成功。

1.4 实验动物与分组 40只6～8周龄的C57BL/6近交系小鼠，雌性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物分组及rDC的免疫如下:按随机数字表法分成A、B、C、D组，每组10只。A组:正常组，分别在Day0、Day7、Day14，按0.1 ml/只的量腹腔注射磷酸盐缓冲液 (PBS)。B组:OVA组，未做处理的哮喘组。C组:mDC组，分别在Day0、Day7、Day14，按5×106/鼠的细胞量腹腔注射mDC。D组:rDC组，分别在Day0、Day7、Day14，按5×106/鼠的细胞量腹腔注射rDC。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 取材 末次雾化激发24 h后 (第21天)，采用摘除眼球取血的方法收集标本。取血静置1 h，经离心机分离血清。－20℃保存，待测细胞因子。脱颈处死小鼠，暴露胸腔和气管，分离气管，结扎右主支气管，向左肺内灌注1 ml的PBS，停留片刻后回吸，获得肺泡灌洗液。常规留取右肺中叶，行病理学观察。

1.5.2 肺部标本的制备 取右肺中叶，用4%多聚甲醛固定48 h后石蜡包埋，切成4 μm厚切片，行苏木素－伊红 (HE)染色制片。观察肺部的炎症病理改变。

1.5.3 ELISA法检测小鼠血清中IL－12、IgE及肺泡灌洗液中IL－12的表达水平 按照R＆D公司ELISA试剂盒操作，在BIO－RAD 680酶标仪上读取结果。

1.6 统计学方法 用SPSS 13.0统计软件进行处理分析，计量资料以 ()表示，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学观察 (HE染色) 正常组小鼠支气管黏膜上皮、肌层及肺泡壁完整。支气管管腔和肺泡腔规则，结构正常，无炎性细胞浸润。支气管管腔、肺泡腔内无分泌物潴留(见图1)。OVA组哮喘小鼠 (见图2)与mDC组哮喘小鼠(见图3)的病理学表现相似。支气管管壁增厚，管腔狭窄，支气管上皮细胞增生明显，可见较多炎性细胞浸润 (以嗜酸粒细胞和中性粒细胞为主)，支气管周围小血管扩张、充血，肺泡壁增厚且明显塌陷，肺泡腔明显减少，其内可见较多炎性细胞浸润，支气管管腔、肺泡腔内可见分泌物潴留。rDC组哮喘小鼠支气管壁明显变薄，小血管轻度扩张、充血，炎性细胞浸润较前两组明显减少，肺泡壁塌陷较前两组减轻 (见图4)。

2.2 血清中IL－12、IgE水平的比较 4组小鼠血清中IL－12、IgE比较，差异均有统计学意义 (P＜0.01)。其中rDC组血清中IL－12的水平高于OVA组，IgE低于OVA组，差异均有统计学意义 (P＜0.01)。mDC组血清中IL－12、IgE水平与OVA组比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表1)。

图1 正常组小鼠肺组织 (HE，×100)Figure 1 Lung tissues of normal group mice(HE， ×100)

表1 4组小鼠血清中IL－12及IgE水平的比较 (，pg/ml)Table 1 Comparison of IL－12 and IgE levels between four groups

表1 4组小鼠血清中IL－12及IgE水平的比较 (，pg/ml)Table 1 Comparison of IL－12 and IgE levels between four groups

注:与OVA组比较，*P＜0.01，△P＞0.05

组别 只数IL－12 IgE正常组 10 28±4 25±5 OVA组 10 20±4 62±8 mDC组 10 18±5△ 58±8△rDC组 10 57±6* 32±5*F 值0.00 0.00 149.4 77.3 P值

2.3 肺泡灌洗液中IL－12水平的比较 4组小鼠肺泡灌洗液中IL－12水平比较，差异有统计学意义 (F=81.2，P＜0.01)。其中rDC组肺泡灌洗液中IL－12水平高于OVA组，差异有统计学意义 (P＜0.01);mDC组肺泡灌洗液中IL－12水平与OVA组比较，差异无统计学意义 (P＞0.05，见表2)。

表2 4组肺泡灌洗液中IL－12水平的比较 (，pg/ml)Table 2 Comparison of IL－12 level in lavage fluid between four groups

表2 4组肺泡灌洗液中IL－12水平的比较 (，pg/ml)Table 2 Comparison of IL－12 level in lavage fluid between four groups

注:与OVA组比较，*P＞0.05，△P＜0.01

组别 只数IL－12正常组 10 29±6 OVA组 10 17±4 mDC组 10 17±5*rDC组 10 49±7△

图2 OVA组小鼠肺组织 (HE，×100，右下角×400)Figure 2 Lung tissues of OVA group mice(HE， ×100，the lower right corner×400)

图3 mDC组小鼠肺组织 (HE，×100，右下角×400)Figure 3 Lung tissues of mDC group mice(HE， ×100，the lower right corner×400)

图4 rDC组小鼠肺组织 (HE，×100，右下角×400)Figure 4 Lung tissues of rDC group mice(HE， ×100，the lower right corner×400)

3 讨论

本研究利用mDC与肺基质细胞上清液共培养获得的rDC具有诱导免疫耐受的特性，接种至用OVA激发的哮喘小鼠。本研究结果显示，这种rDC可减轻小鼠肺部炎症表现，上调Th1型细胞因子IL－12水平并下调IgE水平。

哮喘是一种由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性非特异性炎症。许多研究已证实T1亚群辅助细胞/T2亚群辅助细胞(Th1/Th2)平衡失调、Th2细胞活化亢进是哮喘发病机制中的关键环节［9］。IL－12在Th1型细胞因子免疫调节中起决定因素，并有研究表明IL－12不足时Th1反应低下而Th2反应增强。Zedan等［10］研究发现，哮喘儿童与正常儿童相比，血清IL－12水平明显下降，并提出IL－12的产生不足可能是哮喘发病机制中的重要组分。IL－12可有效地促进Th1型细胞因子如干扰素γ(IFN－γ)的产生，抑制IgE的合成，抑制过敏原诱导的气道高反应性及嗜酸粒细胞的浸润［11］。而IFN－γ又可反过来加强IL－12的作用，这样便形成了一个正反馈循环，加强了Th1的应答反应。另一方面又可抑制Th2型细胞因子如IL－13、IL－4的产生，抑制Th2的应答反应，降低B淋巴细胞合成过多的IgE，减轻气道炎症反应，降低气道阻力，改善肺功能。IgE是一种反应抗体，通常情况下，主要由鼻咽部、扁桃体、支气管等黏膜固有层的浆细胞产生，IgE水平的降低意味着IgE介导超敏反应的降低，血清中IgE水平取决于疾病炎症反应的程度。

通过rDC干预后，IL－12的表达水平较哮喘小鼠高，且肺泡灌洗液和血清中IL－12的变化一致，而且IL－12能抑制过敏原诱导的气道高反应性及嗜酸粒细胞在气道聚集，使rDC组病理切片及灌洗液中的嗜酸粒细胞浸润减少，炎症减轻。提示rDC抑制哮喘气道炎症的作用可能与上调IL－12的表达，并抑制IgE产生有关。从而既纠正了Th1及Th2型细胞因子失衡又减轻了哮喘的气道高反应性。

综上所述，经诱导产生的rDC对哮喘小鼠气道炎症有治疗作用。rDC应用于哮喘治疗具有良好的前景。

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