液体乳和乳饮料中β-内酰胺酶检测方法的研究

张明，郑凤娥，杨春晖

（国家加工食品及添加剂质量监督检验中心，沈阳产品质量监督检验研究院，辽宁沈阳110136）

在我国乳品工业中，人们广泛采用抗生素来治疗奶牛的乳腺炎和其它感染性疾病，这导致我国乳制品中抗生素含量较高。2001年9月，我国农业部颁布了《无公害食品生鲜牛乳》行业标准，该标准规定生鲜乳中抗生素“不得检出”。为了防止抗生素在乳制品中的残留，不法生产者在牛奶中加入生物解抗剂，这种解抗剂就是从微生物中提取的β-内酰胺酶。该酶能催化水解6-氨基青霉烷酸（6-APA）和7-氨基头孢烷酸（7-ACA）及其N-酰基衍生物分子中β-内酰胺环酰胺键，其对青霉素具有破坏或抑制作用[1-3]。经生物解抗剂处理过的牛奶存在以下潜在危害：①降解产物是抗生素的类似物，人长期饮用会引起耐药性；②解抗剂滥用会引入大量的致病菌、致癌物等有害物质，危害人民身体健康。③产品以次充好，扰乱市场。本研究通过舒巴坦特异性抑制β-内酰胺酶的这种作用，在样品中先后加入舒巴坦和青霉素，采用杯碟法测定抑菌圈大小差异来检测β-内酰胺酶。然后对菌种、培养基、所选用试剂浓度和培养时间等方面进行研究，确定了检测方法条件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和培养基

藤黄微球菌（Micrococcus Luteus），菌种号CMCC（B）28001，中国药品生物制品检定所。

抗生素Ⅰ号培养基：蛋白胨5 g，磷酸氢二钾3 g，牛肉粉3 g，琼脂13 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.5～6.6。

菌种培养基（LB 营养琼脂）：蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏3.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂15 g～20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.2 主要试剂和仪器

β-内酰胺酶标准品：纯度≥90%，酶活1 200 IU/mg，中国药品生物制品检定所；舒巴坦标准品：纯度89.2 %，中国药品生物制品检定所；青霉素G：色谱级，纯度97%，中国药品生物制品检定所。

恒温培养箱（DHP9082）：上海一恒科技有限公司；抑菌圈自动测量分析仪（ZY-300IV）：北京先驱威锋技术开发公司；培养皿：内径（90±0.5）mm，皿底平整光滑，厚薄均匀无凹凸现象；血球计数板；牛津杯：不锈钢管，外径[（7.8±0.1）mm]，内径[（6.0±0.1）mm]，高度[（10.0±0.1）mm]；陶瓦盖：内径110 mm，外径116 mm，高度26 mm。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备

取新鲜培养的藤黄微球菌LB 营养琼脂斜面培养物，每只管中加入2 mL～3 mL 灭菌生理盐水，将菌苔洗下，振荡均匀，合并菌液至灭菌试管中。

1.2.2 检定用培养基的制备

在无菌培养皿中注入抗生素Ⅰ号培养基，作为底层培养基，水平静置，使其凝固。将适量菌悬液加入到55 ℃左右的菌种培养基中，混匀，然后注入铺有底层培养基的培养皿中，均匀摊开、凝固。在每个培养基表面放置4 个牛津杯，呈均匀对称分布。检定用培养基平板需当天配置使用。

1.2.3 试样制备

样品：将25 mL 样品混合均匀，待处理。阴性对照样品：0.8%灭菌生理盐水。阳性对照样品：酶活力为0.1 IU/mL β-内酰胺酶的阳性对照样品。将试样和对照品分别加入适量舒巴坦和青霉素G，将上述混合液充分振荡混匀，室温放置1 h。

1.2.4 试样测定

每组试验做3 个重复，将陶瓦盖盖好，培养皿水平放置于培养箱中培养22 h～24 h。培养结束后去除陶瓦盖和牛津杯，使用抑菌圈自动测量分析仪或游标卡尺精确测量抑菌圈直径。

2 结果与讨论

2.1 指示菌和菌悬液

2.1.1 指示菌的选择

因为β-内酰胺酶的检测是以青霉素作为直接检测指标进行的测定，所以选择非致病性的对青霉素敏感的藤黄微球菌作为指示菌[4]。

2.1.2 菌悬液浓度的确定

本研究使用0.8%灭菌生理盐水3 mL 将新鲜培养的藤黄微球菌洗涤下来制成菌悬液[5]，使用血球计数板对其计数，得出菌悬液浓度为1×109cfu/mL。

2.2 培养基的选择及用量

2.2.1 培养基的选择

下层培养基根据药典采用抗生素Ⅰ号培养基，用量为10 mL。

上层培养基分别考察了抗生素Ⅳ号培养基和LB营养琼脂[6]按照本方法进行操作，两种培养基的实验结果见图1。

从实验结果可以看出藤黄微球菌在抗生素Ⅳ号培养基上不能良好地生长，而在LB 营养琼脂上生长良好，青霉素可以抑制藤黄微球菌在LB 营养琼脂上的生长。因此选择LB 营养琼脂作为上层培养基使用。

2.2.2 上层培养基的用量

为考察上层培养基用量对实验结果的影响，我们做了如下实验：固定下层培养基用量为10 mL，上层培养基（含1×109cfu/mL 藤黄微球菌）用量分别为4 mL、5 mL、6 mL。配制一定浓度青霉素G 的生理盐水标液，按照本方法进行操作。实验结果见表1。4 mL 上层培养基产生的抑菌圈平均直径为26.54 mm；5 mL 上层培养基产生的抑菌圈平均直径为24.16 mm；6 mL 上层培养基产生的抑菌圈平均直径为23.53 mm。从实验数据中可以看出，上层培养基的用量越少，溶液渗透后所形成的抑菌圈越大。但考虑到双层平板在制备的过程中对上层培养基温度、培养基的水平程度的要求，选择5 mL 最为适宜。

表1 上层培养基用量对实验结果的影响Table 1 The effects of upper medium volume on the experimental results

2.3 青霉素G 浓度的选择

3 个抗生素检测平板，每个平板上放置3 个牛津杯，杯中分别加入200 μL 含有0.05 μg/mL，0.1 μg/mL，0.2 μg/mL，0.5 μg/mL，1.0 μg/mL，1.5 μg/mL，3.0 μg/mL，6.0 μg/mL，12 μg/mL 青霉素G 的10%脱脂牛奶，37 ℃培养18 h～22 h。实验结果见表2。

表2 不同浓度青霉素的抑菌圈实验Table 2 The inhibition zone test of different concentrations of penicillin

在杯碟法试验中，产生的抑菌圈越大，误差就越大。一般选择抑菌圈大小在24 mm 左右较为适宜。0.5 μg/mL 的青霉素G 在抗生素检定平板上可产生稳定的24 mm 的抑菌圈直径，为了使结果更便于观察，我们选择0.5 μg/mL 的青霉素G 作为使用浓度。

2.4 β-内酰胺酶对抑菌效果的影响

2.4.1 β-内酰胺酶对藤黄微球菌生长的影响

在每个抗生素检测用培养基上均匀放置6 个牛津杯，在每个杯子中分别加入200 μL 不同浓度β-内酰胺酶（0.001 IU/mL，0.1 IU/mL，1 IU/mL，10 IU /mL，100 IU/mL，1000 IU/mL） 的标准溶液，37 ℃培养18 h～22 h，观察牛津杯周围的抑菌圈情况。实验结果见图2。

从实验结果可以看出，各种浓度的β-内酰胺酶均没有形成抑菌圈，说明在选择的浓度范围内β-内酰胺酶对藤黄微球菌的生长没有影响。

2.4.2 β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响

配制含有不同浓度单位为IU/mL 的β-内酰胺酶（0、5×10-6、5×10-5、5×10-4、5×10-3、0.05、0.5、5）的奶样，在奶样中加入青霉素G，使终浓度为0.5 μg/mL。

在每个抗生素检测用培养基上均匀放置4 个牛津杯，在每个杯子中分别加入200 μL 上述样液37 ℃培养18 h～22 h，观察抑菌圈情况。实验结果见表3。

表3 β-内酰胺酶对青霉素抑菌作用的影响Table 3 The inhibitory effects of β-lactamase on penicillin

从实验结果可以看出浓度在0.05 IU/mL 及以上的β-内酰胺酶可以将0.5 μg/mL 青霉素G 完全分解，使其失去抑菌作用。

2.5 舒巴坦用量的确定

2.5.1 舒巴坦抑菌浓度的确定

配制含有不同浓度舒巴坦（0、12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL）的奶样。

在每个抗生素检测用培养基上均匀放置4 个牛津杯，在每个杯中分别加入200 μL 以上不同舒巴坦浓度的奶样37 ℃培养18 h～22 h。观察是否产生抑菌圈，以确定不产生抑菌圈的最高舒巴坦浓度。实验结果见表4。

表4 舒巴坦抑菌浓度实验结果Table 4 The results of sulbactam MIC

从试验结果中可以看出，舒巴坦浓度在200 μg/mL以下均不产生抑菌圈，表明200 μg/mL 的舒巴坦浓度是控制抗生素的临界浓度，因此可以确定舒巴坦的安全使用浓度范围为0～200 μg/mL。为了更安全起见，选取0～100 μg/mL 浓度的舒巴坦通过以下试验确定最佳使用浓度。

2.5.2 舒巴坦使用浓度的确定

牛奶解抗剂的推荐使用浓度为4 mL，牛奶解抗剂加入到4 t 牛奶中。本实验将解抗剂加到10%空白牛奶中，稀释配成牛奶解抗剂浓度为10-4的奶样（高于推荐使用浓度100 倍），用来确定舒巴坦的使用浓度。

2 个抗生素检测平板，每个平板上平均放置3 个牛津杯，在2 个检测平板的1 个牛津杯中均加200 μL含有0.5 μg/mL 青霉素的空白奶样；其余4 个杯子杯子中分别添加200 μL 含有0.5 μg/mL 青霉素G、舒巴坦（25，50，75，100 μg/mL）的解抗剂浓度为10-4的奶样，37 ℃培养18 h～22 h。观察产生抑菌圈情况，以确定舒巴坦最终适用浓度。结果见表5。

表5 确定舒巴坦使用浓度试验数据Table 5 The experimental data of the concentration of sulbactam using

由试验结果可以看出，添加舒巴坦浓度为25 μg/mL时，抑菌圈直径为16.99 mm，当添加舒巴坦浓度为50、75、100 μg/mL 时，抑 菌 圈 直 径 分 别 达 到25.01，25.08，25.09 mm，与仅添加青霉素形成的抑菌圈直径25.05 mm 相差很小。即当舒巴坦的浓度为25 μg/mL未能完全抑制牛奶解抗剂的活性；舒巴坦超过50 μg/mL时，高浓度牛奶解抗剂的活性均能被抑制，因此，选择舒巴坦的使用浓度为50 μg/mL，这一浓度与200 g/mL的舒巴坦最高安全使用浓度相差4 倍。

2.6 方法检测限

准确配置含有0.02、0.01、0.005、0.001 IU/mL β-内酰胺酶的牛奶样液，按样品检测进行操作，测定牛奶中β-内酰胺酶的检测限，试验结果见表6。实验结果表明，本方法的最低检测限为0.005 IU/mL。

2.7 培养时间的确定

配制含β-内酰胺酶0.005 IU/mL 的10%脱脂奶，做定性试验，共需15 个平行，在培养到18、20、22、24、26 h 时分别取出3 个平皿，测量A、D 圈的大小变化。结果见表7。

表6 牛奶中β-内酰胺酶检测限实验数据Table 6 The experimental data of β-lactamase detection limit in milk

表7 β-内酰胺酶（0.005 IU/mL）培养时间试验数据Table 7 The test data of incubation time with 0.005 IU/mL β-lactamases

由试验结果可知，当培养时间在22 h～24 h 时，A与D 抑菌圈直径之差趋于稳定，所以确定培养时间为22 h～24 h。

2.8 方法的准确度试验

准确配置含有0.005 IU/mL β-内酰胺酶的牛奶标准溶液，使用该方法进行9 次3 组平行测定，考察方法的准确性，试验数据统计见表8。

表8 β-内酰胺酶（0.005 IU/mL）检测准确度试验Table 8 The detection accuracy for β-lactamases（0.005 IU/mL，0.01 IU/mL）

由试验结果可知，0.005 IU/mL 3 组平行9 次测定结果重复性较好，方法准确性较高。

3.9 牛奶中β-内酰胺酶的温度稳定性试验

配含β-内酰胺酶0.005 IU/mL 的奶样，配好后分装到10 mL 离心管中，分别放在－18 ℃～－20 ℃、25 ℃和4 ℃下保藏，分别在1、2、4、8、12 和16 d 进行定性测定，考察不同温度下样品的稳定性，试验结果见表9。

由数据可以看出，在本试验所选的温度条件下（－18 ℃～－20 ℃；25 ℃；4 ℃），含0.005 IU/mL β-内酰胺酶的奶样，可以检出β-内酰胺酶，表明含有的β-内酰胺酶牛奶在－18 ℃、－20 ℃、25 ℃和4 ℃的保存条件下，β-内酰胺酶受温度的影响较小。从实验结果中可以看出随着保存时间的延长，酶活力逐渐下降，但在16 d时0.005 IU/mL 依然能检出。

表9 牛奶中β-内酰胺酶稳定性试验Table 9 The stability test of β-lactamase in milk

3 结论

通过杯碟法对液体乳和乳饮料中β-内酰胺酶进行检测，确定了杯碟法检测液体乳和乳饮料中β-内酰胺酶的各项参数。选择藤黄微球菌作为指示菌，菌悬液浓度要求达到1×109cfu/mL，上层培养基使用LB 营养琼脂，用量为5mL，青霉素G 的使用浓度为0.5 μg/mL，β-内酰胺酶对藤黄微球菌的生长没有影响，0.05 IU/mL的β-内酰胺酶可以将0.5 μg/mL 青霉素G 完全分解，舒巴坦的使用浓度为50 μg/mL。本方法中β-内酰胺酶的最低检测限为0.005 IU/mL；最佳培养时间为22 h～24 h，测定结果的重复性好，方法准确性高。温度试验证明牛奶中存在的β-内酰胺酶在－18 ℃～－20 ℃、25 ℃和4 ℃3 种温度条件下，酶活力变化没有明显的区别。但是无论在那种温度条件下，随着时间的延长，酶活力逐渐下降，0.005 IU/mL 的β-内酰胺酶在3 种温度条件下16 d 依然能检出酶活性。本方法的研究可用于监测和检测目前我国乳制品中使用β-内酰胺酶的情况，为乳制品检测提供技术支持，为国家标准的起草提供了基础的数据，可用于政府部门的监督检验，也可用于企业自检自查。

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