凡纳滨对虾酶解产物过敏原消减效果的评价

王丽娟，胡志和，马霖，胡金民

（1.天津市食品生物技术重点实验室，天津300134；2.天津商业大学生物技术与食品科学学院制药系，天津300134）

随着一个个涉及食品安全的事件的发生，食品安全问题已日益受到人们的关注，食物过敏是涉及食品安全的一个重要问题。虾以其味道鲜美，营养丰富，颇受人们的喜爱，成为人类重要的食物性蛋白质来源之一。然而，虾与蟹等甲壳类动物及其制品又是引起食物过敏较常见的一类食品[1]。因此，研究虾过敏及虾过敏原，探索消减虾过敏原的工艺技术，进一步为开发低敏及脱敏的虾类食品奠定基础。该项研究通过观察并比较凡纳滨对虾木瓜蛋白酶酶解产物的全身性过敏反应及其对豚鼠回肠平滑肌的致敏作用，以评价和比较木瓜蛋白酶酶解产物过敏原的消减效果。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料与试剂

1.1.1.1 动物

英国种Hartly 豚鼠，体重170 g～250 g，雌雄各半：由天津市实验动物中心提供，合格证号为SCXK 津2005-0001。

1.1.1.2 主要试剂及药品

凡纳滨对虾：购于天津市老板娘水产城，为活品；虾蛋白、虾肉及木瓜蛋白酶酶解产物：由本校食品生物技术重点实验室制备，根据实验要求配制成不同浓度的溶液；卵白蛋白：美国Sigma 公司，II 型，有效期2012年9月；木瓜蛋白酶：Papain，Sigma 公司；HRP 标记的羊抗人IgE 抗体：A9667，Sigma 公司，等。

1.1.2 主要仪器

BL-420F 生物信号采集系统：成都泰盟科技有限公司；张力传感器：成都泰盟科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 凡纳滨对虾虾肉蛋白粉的制备

将凡纳滨对虾去壳、去头、去尾、去肠线后放在匀浆器中匀浆，冷冻干燥，储藏于-20 ℃的冰箱中备用。

1.2.2 凡纳滨对虾蛋白质的制备

将凡纳滨对虾去壳、去头、去尾、去肠线后放在匀浆器中匀浆，然后加入4 倍体积的冷丙酮（-20 ℃预冷过夜），8 000 r/min 离心15 min，收集沉淀物并转移至干净的滤纸上，分散并让其在室温下空气中风干后粉碎，之后用抽提液[1 mol/L KCl and 0.5 mmol/L DTT（1，4-Dithiothreitol），pH7.4]按1：10（体积比）的比例抽提过夜，8 000 r/min，离心15 min，取上清。沉淀用抽提液继续抽提4 h，离心取上清。透析过夜，合并2 上清液后冷冻干燥，储藏于-20 ℃的冰箱中备用[2]。虾肉蛋白粉提取虾蛋白的比率为20%。

1.2.3 凡纳滨对虾虾肉木瓜蛋白酶酶解产物的制备

将凡纳滨对虾虾肉用木瓜蛋白酶进行分解，其酶解条件为酶与底物1：100（g/g），水解温度为60 ℃，底物浓度为5%（g/mL），水解时间为3 h。在酶解过程中，注意控制酶解液pH（6.5）。酶解结束后，将酶解液pH调至中性，用80 ℃灭酶10 min，冷冻干燥备用。

本实验中对水解后的凡纳滨对虾虾肉在4 ℃下8 000 r/m 离心15 min 处理后，将上清冻干后进行酶联免疫检测，检测时用未水解的虾蛋白抽提物作为阳性对照，用正常人血清为一抗作阴性对照。本酶解产物经酶联免疫检测其光密度（OD 值）为0.049。

1.2.4 全身过敏反应

将合格豚鼠随机分组，每组6 只，雌雄各半。在实验室适应1 周后进行初次致敏，激发时静脉注射不成功者舍弃，由于灌胃出现意外者舍弃，保证每组5 只以上。各组的致敏与激发方法见表1。致敏期间每天2 次观察豚鼠的反应，包括一般状态、进食、有无过敏反应等。激发后立即观察60 min 内动物的反应，观察指标及过敏反应评定标准[3]如表2。

1.2.5 致敏豚鼠离体回肠平滑肌过敏性收缩试验

将合格豚鼠随机分组，每组5 只，雌雄兼用。豚鼠在实验室适应1 周后，各组先用卵白蛋白等物质进行致敏。致敏时行腹腔注射或灌胃，每次每只豚鼠给予1.0 mL，隔日1 次，共3 次。末次注射后第14 天进行离体肠平滑肌过敏原攻击试验，取致敏豚鼠，放血处死，取出回肠一段，按离体器官装置进行描记，浴管内均加入30 mL 台氏液。待肠收缩曲线基线稳定后，进行过敏抗原攻击，观察、记录肠收缩幅度，并比较各组肠收缩变化率[4]。

表1 全身过敏反应致敏与激发方法Table 1 Sensitization and Stimulation methods of generalized anaphylaxis

表2 豚鼠过敏反应判定标准Table 2 Standard of generalized anaphylaxis in guinea pig

肠收缩变化率=[（攻击后的肠平滑肌收缩力-攻击前的肠平滑肌收缩力）/攻击前的肠平滑肌收缩力]×100%。

2 结果与分析

2.1 全身过敏反应

按照表1 的分组和表2 的评判指标和评分标准，用卵白蛋白、凡纳滨对虾蛋白、虾肉及虾蛋白和虾肉的木瓜蛋白酶酶解产物对各组豚鼠分别进行致敏和激发，激发后密切观察、记录，并进行评分。各组动物全身过敏反应的结果见表3。

表3 中，1 组至5 组为腹腔注射致敏，静脉注射激发过敏反应。由表3 中的结果可以看出，凡纳滨对虾蛋白致敏并激发组（2 组）存在有明显的过敏反应，表现为Ⅰ型速发型变态反应，全部出现过敏性休克死亡，反应与阳性对照品卵白蛋白（1 组）极其相似；凡纳滨对虾虾肉组（4 组）的过敏反应与虾蛋白及卵白蛋白组也极其相似。而虾蛋白和虾肉木瓜蛋白酶酶解产物组（3 组和5 组）的过敏反应则明显减轻（与虾蛋白或虾肉组比较，P＜0.01），无死亡。

表3 过敏反应结果与评分Table 3 Results and score of generalized anaphylaxis

6 组至9 组为灌胃给予不同剂量的虾肉进行致敏，再灌胃给予致敏双倍剂量的虾肉进行激发，观察豚鼠的过敏反应。由表3 中的结果可以看出，虾肉各剂量组豚鼠的过敏反应强度与其剂量间将呈现一定的量效关系；8 组与4 组比较（同剂量，不同途径致敏），豚鼠的过敏反应有所减轻；将虾肉溶液过滤后再灌胃（9 组），反应与未过滤组（8 组）间无明显差别。

10 组至13 组为灌胃给予不同剂量的虾肉酶解产物进行致敏，再灌胃给予致敏双倍剂量的虾肉酶解产物进行激发，观察豚鼠的过敏反应。由结果可见，酶解产物各剂量组的豚鼠过敏反应发生率仍很高，但反应的程度较同剂量虾肉组则明显减轻；将酶解产物过滤后灌胃，过敏反应也有较大的改善，反应及评分与注射致敏组无明显差别。

2.2 致敏豚鼠离体回肠平滑肌过敏性收缩试验

各组分别用卵白蛋白、虾蛋白、虾肉以及虾蛋白和虾肉的木瓜蛋白酶酶解产物致敏，将致敏后的离体回肠用相应殖民无进行攻击，肠平滑肌收缩活动的变化见表4。

表4 中，1 组至5 组为腹腔注射致敏。由表4 中的结果可以看出，用卵白蛋白（1 组）、虾蛋白（2 组）和虾肉（4 组）致敏后的离体肠在受到相应过敏原攻击后，肠平滑肌的收缩力明显增强，各组间差异无显著性。虾蛋白酶解产物致敏组（3 组）和虾肉酶解产物致敏组（5 组）的肠平滑肌在受到相应过敏原攻击后，其收缩力无明显变化，分别与虾蛋白和虾肉组进行比较，差异均十分显著（P＜0.01）；虾蛋白和虾肉酶解产物组间的肠收缩力改变无显著性差异。

表4 卵白蛋白、虾蛋白、虾肉以及木瓜蛋白酶酶解产物的致敏作用比较Table 4 Comparison of sensitization among egg-white protein，shrimp protein and productions enzymolysised

6 组和7 组为灌胃给予虾肉和虾肉木瓜蛋白酶酶解产物进行致敏。由结果看出，经灌胃途径致敏的肠平滑肌攻击前后肠收缩力的变化无论虾肉致敏，还是酶解产物致敏，与腹腔注射途径比较，肠收缩变化率均无显著性差异；虾肉酶解产物与虾肉比较，肠收缩力变化十分显著（P＜0.01）。

剪辑肠收缩曲线，图中标明致敏物质及攻击物质，箭头代表攻击的时刻及攻击物质加入的量。结果见图1。

3 讨论

食物过敏是世界各地普遍存在的一个严重问题，有约33%左右的过敏反应由食物引起，有时会出现过敏性休克，严重时甚至会危及生命[5-6]。食用虾等海产品过敏引起过敏性休克的病例也时有发生[7-8]。研究者对165 例慢性荨麻疹患者食物过敏原分析，对蟹过敏者占67.95%，对虾过敏者占52.56%[1]。因此，设法消减虾中的过敏原，让人们吃的安全十分必要。

该实验工艺制备的虾肉蛋白粉及提取的虾蛋白具有很强的致敏性，其过敏反应的强度或效价与卵白蛋白相近。将该虾肉及虾蛋白经木瓜蛋白酶水解得到酶解产物，将此产物给豚鼠进行注射和灌胃两种途径致敏，在全身过敏反应及致敏的豚鼠回肠平滑肌收缩实验中，酶解产物的致敏性均明显降低，与酶联免疫检测的结果一致。实验结果显示，酶解产物中的过敏原未能完全消除，尤其灌胃直接给予酶解产物，过敏反应虽明显减轻，但发生率未见降低。将此酶解产物过滤后再进行致敏及激发，过敏反应的发生率和过敏严重程度均明显改善，可能虾肉酶解产物中的未溶解物质具有一定的致敏性。因此，建议在实际应用此类产品进行食品制作前，要进行过滤处理，可以大大减少其中的致敏物质；也可以进一步优化提取和消减虾肉过敏原的工艺，使过敏原消减效果更加理想。

[1] 朱薇,付香莲,李加飞.165 例慢性荨麻疹患者食物过敏原检测结果分析[J].皮肤病与性病,2010,3(4):4-5

[2] 王丽娟,胡志和,周汛,等.南美白对虾蛋白质酶解产物过敏原消减效果研究[J].食品科学,2010,31(17):263-266

[3] 徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].2 版.北京:人民卫生出版社,1991:1200

[4] 徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].3 版.北京:人民卫生出版社,2003:1411

[5] Ranc,Dutau G.Asthma and food allergy:report of 163 pediatric cases[J].Arch Pediatr,2002,9 Supple:402-407

[6] Khoo J,Shek L,Khor E S,et al. Pattern of sensitization to common environmental allergens amongst atopic Singapore children in the first 3 years of life [J]. Asian Pac J Allergy Immunol,2001,19(4):225-229

[7] 安爱芝,孙月芹.食坑虾引起过敏性休克1 例[J].医学理论与实践,2003,16(8):87

[8] 许岩,许红.食用虾爬子引起过敏性休克1 例[J].沈阳医学院学报,2000,2(2):108