不同酵母发酵对葡萄酒香气成分的影响

李双石，李浡，吴志明，王晓杰，苏宁

（1.北京电子科技职业学院，北京100029；2.中粮华夏长城葡萄酒有限公司，河北昌黎066600）

葡萄酒酿造是一个复杂的微生物学过程，其中酵母菌是葡萄酒发酵工业中占主导地位的微生物。葡萄酒的酿造就是在酵母菌的作用下，采用自然发酵或者纯种发酵，将葡萄原料中各种潜在质量在酒中充分表现出来。在酒精发酵过程中，酵母菌在将糖转化为酒精和二氧化碳的同时，还产生很多副产物，它们直接影响到葡萄酒的口感和风味，决定了酒品质的优劣[1]。葡萄酒香气是衡量葡萄酒质量的重要指标，它们对葡萄酒的产地风格和典型性均起决定性的作用。葡萄酒的香气物质根据来源分类，可分为三大类，即葡萄浆果香气、发酵香气和陈酿香气，葡萄酒总体芳香成分的大部分是由发酵香气组成的[2]。前期研究表明，葡萄酒中含有多种香气物质，目前已经报道的有1 300 多种，主要包括醇类、酯类、酸类、醛类、酮类、萜烯类等，其中，超过400 种的成分是由酵母发酵产生的[3]。

国内对葡萄酒中香气成分研究报道较多，但关于酵母对葡萄酒香气的影响报道较少。本研究采用自然发酵、本土优选酿酒酵母菌株Y14 接种发酵、国外商业葡萄酒活性干酵母F15 接种发酵分别进行葡萄酒酿造实验，并利用顶空固相微萃取（HS-SPME）和气相色谱与质谱联用技术（GC-MS）分析葡萄酒中的香气成分，研究不同酵母对葡萄酒中挥发性香气成分的影响，旨在为酿酒工艺实施提供理论参考和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：本土酿酒酵母菌株Y14 分离自酿酒葡萄的自然发酵液；对照酿酒酵母F15 是进口葡萄酒商业活性干酵母Zymaflora F15：法国拉曼公司。

供试葡萄原料：2011年10月市售成熟的巨峰葡萄（Kyoho）。

主要仪器设备：Agilent6890A 气相色谱仪和Agilent 5975B 质谱仪联用（购自美国Agilent 公司）；固相微萃取装置和PDMS/CAR/DVB 固相微萃取头（50/30 μm）（购自美国Supelco 公司）。

1.2 方法

1.2.1 葡萄酒发酵实验

用2～4 层经灭菌的纱布将新鲜、成熟的葡萄原料包起来，在无菌条件下用手挤压，将300 mL 葡萄汁置于无菌三角瓶中，并将残余的葡萄皮及葡萄籽也加入瓶内。在葡萄汁中加入亚硫酸至SO2有效含量达到60 mg/L，混合均匀，用封口膜密封。然后依不同的处理方法不接种酵母或接种活化好的酵母，25 ℃静置发酵，每日分3 次称量发酵液重量，至发酵液重量不变时即为发酵终止。酒精发酵结束后，对葡萄酒样进行取样，低温保存，待进一步成分分析。

3 种不同的酵母接种处理有：不接种纯种酵母，即自然发酵；本土优选酿酒酵母菌株Y14 活化后，依3%接种量接种；进口商业活性干酵母F15 依产品说明书活化接种。

1.2.2 葡萄酒样香气成分提取

顶空固相微萃取方法：将不同处理的葡萄酒样用0.45 μm 膜过滤，吸取5 mL 待测葡萄酒样品加入至15 mL 的顶空微萃取样品瓶中，同时放入1 g NaCl 和磁力转子，迅速用样品盖拧紧后置于恒温磁力搅拌加热平台上。将已活化的萃取头插入样品瓶的顶空部分，萃取头距离液面1 cm。于40 ℃下吸附30 min，吸附后的萃取头插入气相色谱进样口，于250 ℃热解析8 min。

1.2.3 葡萄酒样香气成分分析

GC-MS 分析：DB-FFAP 毛细管色谱柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）；载气为高纯氦气，流速为1 mL/min；手动进样，进样量1 μL，采用不分流模式；柱温箱升温程序为：40 ℃保持5 min，再以10 ℃/min 的速度升温至240 ℃，保持2 min。质谱接口温度为280 ℃，离子源温度为230 ℃，电离方式EI，离子能量70 ev，质量扫描范围为20 u～350 u。

香气物质定性定量分析：利用质谱全离子扫描图谱，依据已有标样的色谱保留时间和质谱信息、NIST05 标准谱库比对结果对葡萄酒中的香气物质进行定性分析。采用气相色谱峰面积归一化法确定各香气组分的相对含量。

2 结果与讨论

2.1 不同酵母发酵葡萄酒样香气成分分析

不同酵母发酵的葡萄酒样中共检测出挥发性香气成分81 种，表1 列出了60 种主要成分，其中含醇类30 种、酯类20 种、酸类10 种。

葡萄酒自然发酵就是利用葡萄果皮表面或空气中的天然野生酵母进行发酵的过程。自然发酵过程是一个复杂的酵母菌群消长和更替的过程，有大量的酵母菌种参与。由表1 可见，自然发酵的葡萄酒样中香气成分最复杂，共检测出53 种香气成分，由此可见多种酵母菌种的参与有助于增加葡萄酒中香气物质组成的复杂性。自然发酵酒样中主要的香气成分有异戊醇（33.11%）、苯乙醇（8.63%）、三甲基硅醇（2.52%）、三氟乙酸基油醇（2.46%）、异丁醇（2.45%）、棕榈酸乙酯（2.30%）和辛酸（2.25%）。

目前葡萄酒工业生产中大量使用商用葡萄酒活性干酵母，优良的葡萄酒活性干酵母能使性能优良的酿酒酵母在整个葡萄酒酿造过程中占优势，能确保葡萄酒发酵过程的稳定和葡萄酒质量的稳定。本研究采用国外商业活性干酵母F15 接种发酵，此葡萄酒样中共检测出47 种香气成分，主要的香气成分为乙酸乙酯（19.91%）、异戊醇（14.44%）、醋酸（12.75%）、苯乙醇（10.47%）和异丁醇（2.90%）。

表1 不同酿酒酵母菌株发酵葡萄酒中香气物质的含量Table 1 Volatile aroma components of wines fermented by different yeast strains

续表1 不同酿酒酵母菌株发酵葡萄酒中香气物质的含量Continue table 1 Volatile aroma components of wines fermented by different yeast strains

由于国内的葡萄酒厂主要靠引入国外活性干酵母进行葡萄酒生产，葡萄酒产品出现了同质化的缺陷，因此，性能优良本土葡萄酒酵母菌株的开发和利用成为当今葡萄酒研究领域的热点[4]。本研究采用的本土优筛酵母Y14 发酵的葡萄酒样中共检测出39 种香气成分，主要的香气成分为异戊醇（20.97%）、乙酸乙酯（13.10%）、苯乙醇（11.66%）、醋酸（9.46%）、三甲基硅醇（3.71%）、乙酸苯乙酯（2.28%）和异丁醇（2.20%）。

2.2 不同酵母发酵葡萄酒样香气成分比较

2.2.1 醇类组分比较

葡萄酒中的醇类物质是构成葡萄酒发酵香气的主要物质，它们主要是酵母酒精发酵过程中氨基酸或糖代谢的产物。适量的醇能给葡萄酒带来良好香气，它们可使葡萄酒的香气更为复杂、浓郁；但多数醇类具有不愉快的香气，可能对葡萄酒的香气质量产生负向贡献[2，5]。由表1 可以看出，醇类物质是所有发酵酒样香气组成的主体成分。所有葡萄酒样中共检测出30种醇类物质，但共有成分仅有6 种。

在不同酒样中含量最高的醇类物质均为异戊醇，其中自然发酵酒样中此组分含量最高为33.11%，其次是本土菌株Y14 发酵酒样为20.97%，F15 发酵酒样中此组分含量最低，仅为14.44%。异戊醇则具有青草或香蕉的香气，可使葡萄酒具有白兰地的香型。在不同酒样中含量位居第二的醇类物质都是苯乙醇，此组分在单一菌种发酵酒样中含量较高，分别为11.66%（Y14）和10.47%（F15），而在自然发酵酒样中含量仅为8.63%，由此可见，此物质可能主要是酿酒酵母的代谢产物。苯乙醇可赋予葡萄酒愉快的玫瑰香、紫萝兰香、茉莉花香等多种风味。在不同酒样中含量较高的醇类物质还有三甲基硅醇、异丁醇和正己醇。在自然发酵和本土优选酿酒酵母Y14 的发酵酒样中，三甲基硅醇的含量仅次于异戊醇和苯乙醇，分别占全部香气成分的2.52%和3.71%，而在商业酵母F15 发酵酒样中的含量仅为1.67%，可见此物质可能是本地酵母发酵的特征性香气成分。国外商业酵母F15 发酵酒样中含量位居第三的醇类物质则为异丁醇，它占全部香气成分的2.90%。

从醇类物质的种类区别来看，商业活性干酵母F15 接种发酵的葡萄酒样中含有最多种类的醇类物质，高达17 种，其中特有香气成分有10 种；自然发酵酒样和本土酿酒酵母Y14 接种发酵的酒样中均含有醇类物质13 种，其中分别含有特有香气成分6 种和7种。从醇类物质的含量区别来看，自然发酵酒样中醇类物质的含量最高，高达53.43%；其次是Y14 接种发酵酒样，占41.45%；F15 接种发酵酒样中醇类物质含量最低，只占34.75%。

2.2.2 酯类组分比较

大多数酯类物质具有鲜花或水果的香气，有益于葡萄酒的香气质量。影响葡萄酒中酯类组成和含量的主要因素是葡萄汁的化学组成和所采用的酿造工艺，当以上因素确定时，所选用的酵母菌株对葡萄酒中酯类组成影响就显得至关重要了[6]。本研究中，不同酵母发酵的葡萄酒样中共检测出酯类物质20 种，但共有的酯类组分仅有3 种，它们是乙酸乙酯、乙酸异戊酯和棕榈酸乙酯。

在F15 和Y14 接种发酵酒样中含量最高的酯类成分是乙酸乙酯，此成分含量分别占香气总含量的19.91%和13.10%，乙酸乙酯具有果香和奶油味，而在自然发酵酒样中此组分的含量仅为1.83%。在自然发酵酒样中含量最高的酯类成分是棕榈酸乙酯（2.30%），此物质具有苹果和菠萝香气。乙酸异戊酯在自然发酵酒样中含量较高（1.13%），而在单一菌种接种发酵酒样中的含量均较低，分别为0.42 %（F15）和0.26 %（Y14），乙酸异戊酯具有较强的新鲜果香，可赋予葡萄酒香蕉、梨、苹果的酸甜味。有两种酯类组分（乙酸苯乙酯、辛乙烯二醇正十二烷基酯）仅存在于本地酵母发酵的葡萄酒样中，它们可能是本土酵母发酵生成的特征性香气成分，其中乙酸苯乙酯在Y14 接种发酵的酒样中含量高达2.28%，乙酸苯乙酯可赋予葡萄酒花香。乳酸乙酯仅存在于两种单一菌种接种发酵酒样中，乳酸乙酯具有水果和奶油香气，可见此物质可能主要是酿酒酵母的代谢产物。

从酯类物质的种类差异来看，自然发酵酒样中含有最多种类的酯类物质，高达14 种，而在F15 和Y14接种发酵的酒样中分别只含有酯类物质8 种和7 种。不同发酵酒样中所含酯类物质种类区别较大，自然发酵酒样中独有的香气成分有9 种，F15 接种发酵酒样中独有的香气成分有4 种，Y14 接种发酵酒样中独有的香气成分有1 种。从酯类物质的含量差异来看，F15接种发酵酒样中醇类含量最高，占全部香气成分的24.88%；其次是Y14 接种发酵酒样，占19.40%；在自然发酵酒样中醇类物质含量只占12.33%。

2.2.3 酸类

有机酸是保持果酒中酒体平衡和口感清爽特性的主要物质，如适宜的含酸量能使葡萄酒带有新鲜的水果香，能修饰葡萄酒的滋味和口感，并且有利于形成瓶贮酒香[7]。酸类物质的组成和含量同样受到所选用酵母菌株的影响[8]。

由表1 可知，不同酵母发酵的葡萄酒样中共检测出10 种酸类物质，但共有酸类组分仅有2 种，为醋酸和辛酸。F15 和Y14 接种发酵酒样中酸类物质的含量较高，分别占全部香气成分的14.90%和12.99%，且含量最高的酸类物质均为醋酸。自然发酵酒样中酸类物质含量较低，仅占全部香气成分的5.01%，且以辛酸为主。

从酸类物质的种类差异来看，自然发酵、F15 接种发酵和Y14 接种发酵的酒样中分别含有酸类物质6种、7 种和5 种，但种类区别较大，自然发酵酒样中独有的香气成分有2 种，F15 和Y14 接种发酵酒样中独有的香气成分均只有1 种。

3 结论

采用顶空固相微萃取（HS-SPME）和气相色谱与质谱联用技术（GC-MS）分析不同酵母发酵葡萄酒中的香气成分，结果表明，不同的酵母发酵对葡萄酒中香气成分的种类和含量均有较大影响。从不同酵母发酵的葡萄酒样检测到的60 种主要香气成分中仅有11种共有成分，其中仅有3 种共有的主要香气成分，它们分别是异戊醇、苯乙醇和异丁醇。自然发酵的葡萄酒样中香气成分最复杂，醇类物质含量最高；商业葡萄酒活性干酵母F15 产酯和产酸能力均最强；本土优筛酿酒酵母菌株Y14 的产醇、产酯和产酸能力均为中等水平。

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