化学发光微粒子免疫法检测虾肉中磺胺类药物的残留

汪善良　程茹　钟新敏

摘要[目的]通过对比化学发光微粒子免疫分析法（CMIA）和高效液相色谱-质谱法对虾肉中磺胺类药物检测结果的差异，验证公司自研的磺胺类药物化学发光免疫试剂盒的检测效果。[方法]以虾肉为检测原料，采用直接竞争CMIA法对试剂盒进行灵敏度、特异性、精密度、准确度试验。[结果]试剂盒检测灵敏度为1.04 μg/kg、加样回收率为95.25%～104.50%，变异系数（CV）均小于15%；试剂盒检测结果与仪器分析的阴、阳性结果接近。[结论]该方法检测结果稳定、可靠，达到国家相关标准，表明该款试剂盒可满足动物组织中磺胺类药物的快速检测需求。

关键词虾肉；化学发光微粒子免疫法；高效液相色谱-质谱法；磺胺类药物

中图分类号S859.84文献标识码A文章编号0517-6611（2018）08-0170-04

Detection of Sulfonamides Residues in Shrimp by Chemiluminescence Microparticle Immuno Assay（CMIA）

WANG Shanliang， CHENG Ru，ZHONG Xinmin et al

（Guizhou Kwinbon Food Safety ScienceTechnology Co.， Ltd.， Guiyang Guizhou 550009）

Abstract[Objective]To verify the test effect of the companys production of sulfonamides chemiluminescence microparticle immuno assay（CMIA）detection kit， the method of chemiluminescent microparticle immuno assay and high performance liquid chromatographymass spectrometry was used to detect the residues of sulfonamides in shrimp samples， and compared the difference between the two methods of test results. [Method]Shrimp meat as raw material for detection， the kits about sensitivity， specificity， precision and accuracy were tested by direct competitive CMIA method. [Result]The sensitivity of the kit was 1.04 μg/kg， the average recovery was 95.25%-104.50%， the coefficient of variation CV all were less than 15%； The results for shrimp by CMIA method were well consistent with as the results of HPLCMS method.[Conclusion]The results for shrimp by CMIA method are stable and reliable， and meet the relevant national standards. It shows that this kit can meet the requirements of rapid detection of sulfonamides in animal tissues.

Key wordsShrimp；Chemiluminescent microparticle immuno assay（CMIA）；High performance liquid chromaloagraphymass spectrometry（HPLCMS）；Sulfonamides

基金項目2017年贵州省工业和信息化发展专项资金计划项目（2017002）；2016年贵阳市经济技术开发区科学技术计划项目；2016年贵州省技术创新项目；2016年贵州省科技厅社会攻关计划项目（黔科合〔2016〕支撑2908号）；2017年贵州省科技支撑项目（黔科合支撑〔2017〕2034）；贵阳市2016年人才创新创业资助项目（筑人才办合同字〔2016〕第13号）。

作者简介汪善良（1979—），男，贵州贵阳人，高级工程师，从事食品安全快速检测技术的研究与开发工作。*通讯作者，硕士，从事农产品质量安全检测技术应用研究。

收稿日期2017-11-16；修回日期2017-12-05

含有特征结构为对氨基苯磺酰胺结构的一类物质可统称为磺胺类药物，该药物是兽医临床上常用的药物，被广泛用于预防和治疗细菌感染性疾病和原虫病等[1]，但也存在严重的副作用，不合理使用很容易在动物组织中造成残留，从而对人类的健康产生潜在的危险[2]。农业部第235号文件规定，磺胺类药物残留量总量限量为100 μg/kg[3]，人体若长期累积过量会产生排尿及造血紊乱、过敏等危害[4]，同时会导致体内细菌对其产生抗药性，并伴随潜在的致癌性[5]。

磺胺类药物目前常规的检测方法是微生物学法，更为精准的分析方法则是仪器分析和免疫法。微生物法因耗时、精度和灵敏度低而无法定量分析使其应用受限；仪器分析方法虽然准确、灵敏，但均存在前处理程序繁杂、操作专业性强等诸多弊端而使得此类方法应用受限。免疫法主要包括酶联免疫法和化学发光微粒子免疫法（CMIA）等，该法因具有操作简单、灵敏度高、成本低、可批量检测等优势，可广泛应用[6-10]。

笔者采用化学发光微粒子免疫分析法对虾肉中11种磺胺类药物进行测定，通过与仪器分析对比，以验证贵州勤邦食品安全科学技术有限公司研制的化学发光免疫试剂盒检测水平是否达到国家标准，从而为虾肉的快速检测提供符合要求的检测手段。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料与主要试剂。

虾肉，购于当地超市，取虾身中间部位。

11种磺胺类药物标准品，纯度>99.6%，美国Sigma公司；甲酸（优级纯）、正己烷（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、乙酸乙酯（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、正丙醇（分析纯）等，以上试剂均来自于贵州嘉润试剂有限公司。

磺胺类药物化学发光微粒子免疫分析测定试剂盒，由贵州勤邦食品安全科学技术有限公司自主研发。

1.1.2主要仪器与设备。

磁免疫全自动化学发光检测仪，由贵州勤邦食品安全科学技术有限公司自主研发；液质联用仪（LC-MS）（TSQ Quantum Ultra），美国Thermo；QL-901涡旋仪，厦门市海康仪器有限公司；FSH-Ⅱ 型高速电动匀浆机，江苏中大仪器厂；DSY-111氮吹仪，上海乔跃电子科技有限公司；HT-200 B恒温振荡器，金坛市城西春兰实验仪器厂；TG16-WS高速离心机，常州市金坛高科仪器厂；微量移液管（单道20～200 μL，100～1 000 μL），美国Thermo 公司；CPA225D电子天平（0.01 mg），江苏明德仪器电子科技有限公司。

1.2方法

1.2.1化学发光微粒子免疫法检测原理。

化学发光微粒子免疫法采用直接竞争原理，首先在磁免疫全自动化学发光检测仪反应杯中依次加入预处理好的虾肉样品、已标记了的磺胺类药物半抗原、已包被单克隆抗体的磁性颗粒。在含有3种物质的反应杯中，虾肉中所含有的磺胺类药物与酶标记抗原形成竞争关系，共同争夺磁性颗粒上的磺胺类药物抗体并与之结合。抗原抗体完成结合过程后，反应杯则被置于磁性分离区域，使得反应杯中与固相未结合的物质被分离，之后将化学发光底物加入其中。

用光子计数仪测定反应杯中各孔的光子计数值，这一数值的大小与磺胺类药物浓度呈良好的负相关，通过标准曲线，再根据物质实际的稀释倍数，即可进一步计算出虾肉样品中残留磺胺类药物的含量。

1.2.2虾肉前处理。

取1支50 mL经清洗、灭菌的离心管，依次加入已经破碎均质处理的虾肉（2.0±0.05）g、50 μL 0.1 mol/L 氢氧化钠、3.8 mL乙腈、2.0 mL乙酸乙酯，涡动混匀，在室温（20～25 ℃）条件下，以3 000 r/min的转速离心5 min；精确移取3 mL离心后上层有机相加入到10 mL已经灭菌处理的玻璃管，将其置于50～60 ℃水浴氮气流中吹干，之后精确加入正己烷1.0 mL，涡动60 s，再加复溶液1.0 mL，再涡动60 s，于室温（20～25 ℃）条件下，以3 000 r/min的转速离心5 min；除去上部有机相，取下层水相留待分析。

1.2.3虾肉中磺胺类药物的测定。

试验前，需保证所有试验所用试剂回温至20～25 ℃，且不起泡。从试剂盒内取出2个反应杯，将磺胺类药物的标准品和虾肉样品对应反应杯进行各自相应编号，各做3个平行，记录各自位置，依次加入磺胺类药物标准品和样品各20 μL、酶标抗原100 μL、磁标抗体50 μL，盖板膜盖板后于25 ℃下避光静置30 min。取下盖板膜，用吸水纸吸干各孔中的液体，继而在各孔中加入250 μL洗涤工作液，每间隔10 s清洗1次，重复5次左右，直至清洗干净，最后用吸水纸拍干。

在各孔中各加入100 μL已制备好的发光底物工作液，进行覆膜处理后于37 ℃条件下避光孵育15 min，再按照每孔50 μL的用量加入终止液，混匀，设置反应杯于波长450 nm处，即刻完成测定。

1.2.4虾肉中磺胺类物质含量的测定。

百分吸光率的计算。标准品或样本的百分吸光率等于標准品或样本对应吸光度值的平均值（双孔）除以第1个标准品（0标准）的吸光度值的平均值，再乘以100%[9]，即：

百分吸光率（%）=B/B0×100% （1）

式中，B为磺胺类药物标准品或虾肉溶液的平均吸光度值；

B0为1 μg/mL标准溶液的平均吸光度值。

标准曲线的绘制与虾肉样本磺胺类药物浓度的计算。

分别对0、1、3、9、27、81 μg/L 6 个浓度梯度的标准液进行化学发光微粒子免疫法测定，以标准品百分吸光率测定值为纵坐标，磺胺类药物标准品浓度（10-9）的对数为横坐标，绘制磺胺类药物的标准曲线图，计算回归方程及相关系数，根据线性方程计算IC50。将所测定虾肉样本的百分吸光率测定值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本的实际浓度。

1.2.5磺胺类药物化学发光测定试剂盒指标检测方法。

1.2.5.1灵敏度。

评价免疫法试验反应灵敏度常用IC50值和最低检测限表示，IC50值即为零标准溶液吸光度值的50%处对应的药物浓度，两者数值的大小与试剂盒的灵敏程度成反比。样品采集地区、种类、预处理方法等因素与最低限检测有较强的关联性，而IC50则不受样本本身的影响，值相对不变[11]。两者结合，可用于试验所用试剂盒灵敏度指标的评价。

分别检测20组空白虾肉样品，计算其所含磺胺类药物的浓度，检测限LOD=S+3SD（其中S为磺胺类药物的浓度平均值，SD为标准差），根据下面公式（2）计算磺胺类药物化学发光测定试剂盒检测实际样品的最低检测限。

LOD=X+3nX2-（X）2n（n-1）（2）

式中，X为试验重复测定空白样品的平均值；

n为试验测定样品数量。

1.2.5.2特异性。

特异性用交叉反应率表示，其是衡量抗体与各抗原决定簇结合能力强弱的指标，试验用一定浓度范围的磺胺类药物类似物取代磺胺类药物标准溶液，测定其标准曲线，计算各药物交叉反应率[12]。交叉反应率（%）=引起50%抑制的磺胺甲噁唑濃度/引起50%抑制的磺胺类似物浓度。

1.2.5.3精密度、准确度。

精密度是反映测定方法对某一特定样品重复测定所得结果的一致程度的指标，其是评定化学发光试剂盒质量最为基本的参数；准确度是试验测定值与真实值间的符合性程度的指标，这一指标大小是通过样品回收率计算所得[13]。

试验检测为阴性的虾肉样本以2.0、4.0、8.0 μg/kg的添加量进行磺胺类药物的添加，各设6个平行，根据试剂盒设计方法进行测定操作，计算样品的回收率。

1.2.5.4磺胺类药物化学发光测定试剂盒与仪器检测结果比较。

准备20份随机抽取的市场在售的虾肉样本，分别进行试剂盒和仪器检测结果对比。试剂盒检测方法根据试剂盒说明书步骤进行操作，高效液相色谱-质谱法仪器检测分析则参考《GBT 21316—2007 动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定 高效液相色谱-质谱法》（动物组织中磺胺类药物的检出限为50 μg/kg）进行操作[13]。

2结果与分析

2.1标准曲线

从图1中可得，标准曲线回归方程为y=-36.56 x+77.156，方程相关系数R2=0.996 2，说明该试剂盒线性关系良好。

2.2磺胺类药物化学发光试剂盒灵敏度的测定

由表1可知，磺胺类药物化学发光快速检测试剂盒标准曲线IC50值的变化范围为3.52～4.59 μg/L，IC50平均值4.04 μg/L。对空白虾肉样品进行20次检测，结果见表2。由表2可知，试验所用试剂盒对空白虾肉的最低检测限为1.04 μg/kg，供试样品平均值0.63 μg/kg，标准差0.14。综合以上2个数据可以得出，该试剂盒灵敏度高。

2.3磺胺类药物化学发光试剂盒特异性的测定

磺胺类药物化学发光试剂盒特异性测定结果如表3所示，试验所用11种抗体对磺胺类似药物的交叉反应率均较低，其中对磺胺二

甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶交叉反应率均极低。综上，得出该试剂盒具有较好的特异性。

2.4磺胺类药物化学发光试剂盒准确度及精密度的测定

在空白虾肉样品中，将磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲噻二唑、磺胺噻唑、磺胺间甲氧嘧啶、酞酰磺噻唑、磺胺吡啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶11种磺胺类药物分别以2、4、8 μg/kg 3个浓度进行添加，每个药物浓度各设置5组平行试验，依照试剂盒提供的步骤方法进行虾肉样品测定，每组试验重复进行3次，分别计算变异系数和回收率，试验测定结果见表4。从表4中可知，虾肉样品的加样回收率范围在95.25%～104.50%，且变异系数均小于15%。与《农业部文件》农医发〔2005〕17号附件2中有关试剂盒备案相关标准相符。

2.5磺胺类药物化学发光试剂盒与仪器检测结果比较分析

2种分析方法测定结果见表5，以50 μg/kg为阳性判定线，当样品实际检测结果低于这一判定线，则以“—”表示，高于或等于时则以实际测定值表示。从表5的检测结果中可得：2种手段所得检测结果相近，从4号样品的检测结果验证，试剂盒的检测限较仪器更低，更易检测出磺胺药物低残留的样品。由此可知，该试剂盒法的检测符合国家检测标准且优于仪器检测。

3结论与讨论

该试验采用的化学发光免疫试剂盒测定虾肉中11种磺胺类药物，通过对其检测方法进行验证，并进一步将试剂盒检测结果与仪器检测进行对比。结果显示，试剂盒标准曲线IC50值的波动范围为3.52～4.59 μg/kg，试剂盒检测灵敏度为1.04 μg/kg、交叉反应率回收率为95.25%～104.50%，变异系数均小于15%，对样品的检测限低且远低于国家最高限量，表明该款化学发光免疫试剂盒灵敏度高、特异性强、准确度和精密度均较高，检测结果与仪器分析结果接近。

该款化学发光免疫检测试剂盒配套磁免疫全自动化学发光检测仪检测样品测试速度高达120 测试/h，可实现连续不间断进样，从加样到测试整个环节高度自动化，具有操作简单、能耗低、设备投入少等优势，符合动物源性食物中磺胺类残留物的快速检测需求。

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