HPLC法同时测定胆木及其制剂中酚酸和生物碱类成分

王静静，蒋俊，朱粉霞，李秀峰，贾晓斌*

(1.江苏大学药学院，江苏镇江212013;2.江苏省中医药研究院国家中医药管理局中药口服释药系统重点研究室，江苏南京210028;3.镇江出入境检验检疫局，国家食品添加剂及调味剂检测重点实验室，江苏镇江212003;4.海南制药厂有限公司黎药工程中心，海南五指山572200)

胆木Nauclea officinalis为茜草科乌檀属植物，是一味重要的黎族药用植物，在我国海南一带比较常用［1］。胆木注射液和胆木浸膏片均是由胆木单味药材制得的中药制剂，具有清热解毒，消肿止痛之功效。临床常用于治疗上呼吸道感染、支气管炎、急性扁桃体炎及咽喉炎等症。

文献报道［2-4］胆木中主要含有生物碱，五环三萜和有机酚酸等，认为这类物质是胆木发挥药效的物质基础。本研究室通过对胆木注射液化学成分的系统研究，发现胆木注射液中的有机小分子化合物主要由有机酚酸类和生物碱苷类组成，并采用液质联用的方式鉴定了短小舌根草苷和异长春花苷内酰胺两个生物碱成分［5］。进一步的研究表明胆木注射液中还含有原儿茶酸和3-表短小舌根草苷。液相色谱图显示上述4个成分的含有量均较高。这类化合物被证实具有一定的抗氧化、抗炎、抗微生物等活性［6-8］，很可能是胆木注射液发挥临床疗效的重要药效成分。

本实验中，作者选择了原儿茶酸、短小舌根草苷、3-表短小舌根草苷和异长春花苷内酰胺4个成分作为含有量测定的指标，所建立的方法简单、可靠，可作为控制胆木药材及其制剂质量的一种方法。

1 仪器与试药

Waters公司高效液相色谱仪(包括Waters在线脱气机，600泵，717进样器，2996紫外检测器)，Empower数据处理系统;KQ5200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，METTLER TOLEDO分析电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，十万分之一)。

乙腈(TEDIA公司，色谱纯)，甲醇(南京化学试剂有限公司，分析纯)，水为超纯水;原儿茶酸(批号110809)购自中国药品生物制品检定所，短小舌根草苷，3-表短小舌根草苷，异长春花苷内酰胺对照品为实验室自制(纯度均高于98%)。

胆木药材(批号:100303，110802)和胆木注射液(批号:110601，110801，110901，101101)均由海南制药厂有限公司提供，药材产于海南省五指山，经南京中医药大学吴德康教授鉴定为药乌檀(N.officinalis)的带皮心材。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备分别精密称取原儿茶酸、短小舌根草苷、3-表短小舌根草苷，异长春花苷内酰胺对照品5.0 mg置同一10 mL量瓶中，加入70%甲醇溶解至刻度，制得混合对照品贮备液。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 胆木供试品溶液的制备取胆木心材(带皮)适量，打成粗粉，精密称取胆木药材粗粉10 g，加入200 mL超纯水，回流提取2 h，趁热过滤，滤液冷却至室温，用超纯水定容至200 mL，混匀，静置，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液即得。

2.2.2 胆木注射液供试品溶液的制备取胆木注射液0.5 mL于10 mL量瓶中，以超纯水定容，过0.45 μm微孔滤膜，滤液作为供试品溶液。

2.3 色谱条件X-SELECT CSHTMC18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱，0～10 min，6%～16%A，10～15 min，16%A，15～40 min，16%～41%A;检测波长:258 nm(原儿茶酸)，243 nm(短小舌根草苷和3-表短小舌根草苷)和226 nm(异长春花苷内酰胺);体积流量1 mL/min;柱温30℃;进样量10μL。混合对照品，胆木药材及胆木注射液样品HPLC色谱图见图1。

2.4 线性关系精密吸取2.1项下对照品贮备液，采用逐步稀释法分别制得原儿茶酸的质量浓度为0.966 0、19.32、38.64、77.28、154.56 μg/mL，短小舌根草苷的质量浓度为0.944 0、18.88、37.76、75.52、151.04 μg/mL，3-表短小舌根草苷的质量浓度为0.954 0、19.08、38.16、76.32、152.64 μg/mL，异长春花苷内酰胺的质量浓度为0.916 0、18.32、36.64、73.28、146.56 μg/mL的对照品溶液。按2.3项下色谱条件进行HPLC分析，以峰面积积分值(Y)对质量浓度(X)进行线性回归，得到各成分的回归方程、相关系数和线性范围，见表1;将混合对照品不断稀释后分析，得到4个成分的最低检测限(LOD:S/N≈3～4)和最低定量限(LOQ:S/N≈10～12)，见表1。

2.5 精密度试验取混合对照品溶液，连续进样6次，按2.3项下色谱条件测定各对照品峰面积，原儿茶酸，短小舌根草苷，3-表短小舌根草苷和异长春花苷内酰胺4种成分峰面积积分值的RSD分别为1.64%、0.42%、0.38%、0.80%，表明精密度良好。

图1 对照品(A1～3)，胆木药材(B1～3)和胆木注射液(C1～3)258、243和226nm下的HPLC图Fig.1 Chromatogram s obtained by HPLC analysis of reference substances(A1-3)，N.officinalis(B1-3)and Danmu Injection(C1-3)at 258，243 and 226 nm

表1 4个待测成分的回归方程、线性范围、LOD、LOQ及相关系数Tab.1 Summary of calibration curves，linear ranges，LODs，LOQs and correlation coefficients for four compounds

2.6 重复性试验取同一批号(100303)胆木药材，按2.2.1项下操作方法制备胆木供试品溶液6份;取同一批号(101101)胆木注射液，按2.2.2项下操作方法制备供试品溶液6份。按2.3项下色谱条件测定，分别计算胆木药材和胆木注射液中4种成分质量分数的RSD为1.74%，1.54%，1.30%，2.17%;1.53%，1.04%，2.32%，1.26%。表明本法重复性良好。

2.7 稳定性试验取2.2项下处理好的同一份胆木供试品溶液和胆木注射液供试品溶液，室温放置，分别在0、1、2、4、8、12、24 h进样，按2.3项下色谱条件测定，以峰面积分别计算胆木药材和胆木注射液中4种成分的RSD为1.12%，0.87%，1.02%，1.26%;1.50%，1.85%，1.18%，2.86%。表明稳定性良好。

2.8 加样回收实验

2.8.1 胆木药材加样回收实验取同一批号胆木药材粗粉6份，分别精密加入一定量(与样品中含有量相当)的对照品。按2.2.1项下操作方法制备，按2.3项下色谱条件测定，分别计算回收率。4种成分的平均回收率分别为98.2%，101.3%，97.4%，99.2%;RSD分别为2.22%，2.06%，1.79%，3.62%。结果见表2，表明该方法准确度良好。

2.8.2 胆木注射液加样回收实验精密移取已知含有量的胆木注射液0.5 mL(批号:101101)，分别精密加入一定量(与注射液中含量相当的)对照品，稀释至10 mL，按2.3项下色谱条件测定，分别计算回收率。4种成分的回收率分别为99.7%，103.0%，98.9%，100.7%;RSD分别为2.44%，1.09%，1.46%，2.16%。结果见表3，表明该方法准确度良好。

表2 胆木药材加样回收实验结果Tab.2 Recoveries of four compounds in N.officinalis

表3 胆木注射液加样回收实验结果Tab.3 Recoveries of 4 compounds in Danmu injection

2.9 样品测定分别取2个不同批号的胆木药材及4个不同批号的胆木注射液按2.2项下方法操作，按上述色谱条件进样分析，将测定值代入标准曲线，计算得含量结果，见表4。

表4 胆木药材及其注射液中4种指标成分的量Tab.4 Contents of four compounds in N.officinalis and Danmu Injection

3 讨论

研究表明，胆木及其制剂中含有的生物碱为吲哚类生物碱和喹啉酮类生物碱，这两类生物碱结构中由于有p-π共轭效应的存在，往往碱性减弱，甚至呈现出中性或弱酸性，所以一方面采用常规的酸提碱沉法提取生物碱并不能达到理想的效果;另一方面，只有选择酸性流动相才能使色谱峰减少拖尾，增加峰形的对称性，较好地分离。本实验分别考察了乙腈-0.05%甲酸、乙腈-0.05%乙酸、乙腈-0.05%磷酸3种不同流动相体系的色谱行为，发现甲酸和磷酸的分离效果最好，经综合考虑本课题组选择了甲酸作为流动相的添加剂。

胆木注射液为胆木的水煎煮提取液经一系列工艺精制得到的胆木提取物溶液，按照一定处方配比精制而得。本实验选择了水煎煮的提取方式，通过比较胆木药材水煎煮提取液及胆木注射液中4种成分之间含有量的比例，可以发现，工艺过程中异长春花苷内酰胺所占比例明显减少;在一定程度上反映了4种成分与胆木注射液工艺的相关性，为胆木注射液质量再评价提供一定的参考。另外，由结果可知，胆木药材中原儿茶酸，3-表短小舌根草苷的含有量较低，在批号110802的药材中测得极少，但在注射液中含量有所升高，异长春花苷内酰胺和短小舌根草苷是胆木及其注射液中的主要成分，是胆木注射液的重要药效物质基础。

目前对胆木药材及其制剂的质量控制研究较少，文献报道［7-11］多以单一成分异长春花苷内酰胺作为指标进行含有量测定。此外，张亚平［12］研究了以芦丁为对照，采用紫外分光光度法测定胆木注射液中总黄酮的质控方法;而具有一定抗炎作用的酚酸类成分及其它种类生物碱的含有量测定尚未见报道，本课题组不久前报道了采用LC/MS鉴定胆木注射液中的短小舌根草苷和异长春花苷内酰胺，在后续的研究中本课题组从胆木注射液中还分离并鉴定出了原儿茶酸和短小舌根草苷的同分异构体3-表短小舌根草苷。本实验可为全面控制胆木注射液质量提供新的分析手段，并为进一步研究胆木注射液的药理药效提供实验依据，为胆木注射液的再评价研究提供参考。

［1］钟捷东.黎族医药［M］.海口:海南出版社，2008:279.

［2］孙敬勇.胆木和山香圆化学成分及其生物活性研究［D］.济南:山东大学，2008.

［3］宣伟东.中药胆木和云南狗牙花活性成分研究［D］.上海:第二军医大学，2005.

［4］范龙.胆木叶的化学成分研究［D］.广州:暨南大学，2010.

［5］朱粉霞，贾晓斌，李秀峰，等.胆木注射液中2种主要生物碱的质谱裂解行为解析及HPLC含量测评［J］.南京中医药大学学报，2011，27(5):492-494.

［6］Varì R，D'Archivio M，Filesi C，et al.Protocatechuic acid induces antioxidant/detoxifying enzyme expression through JNK-mediated Nrf2 activation in murine macrophages［J］.J Nutri Biochem，2011，22(5):409-417.

［7］Nakamura Y，Torikai k，Ohigashi H.A catechol antioxidant protocatechuic acid potentiates inflammatory leukocyte-derived oxidative stress in mouse skin via a tyrosinase bioactivation pathway［J］.Free Radic Biol Med，2001，30(9):967-978.

［8］Abreu P，Pereira A.Two indole alkaloids fromSarcocephalus latifolius［J］.Nat Prod Lett，2001，15(1):43-48.

［9］丁琳，吴德康，蒋俊毅.HPLC法测定胆木注射液中异长春花苷内酰胺的含量［J］.中医药学刊，2006，24(9):1753-1754.

［10］李明慧，丁岗，沈鸣，等.胆木及其制剂中异长春花苷内酰胺的分离鉴定和含量测定［J］.中国天然药物，2006，4(2):104-106.

［11］张俊清，毛彩霓，杨卫丽，等.胆木不同部位异长春花苷内酰胺的含量研究［J］.药物分析杂志，2008，28(10):1654-1657.

［12］张亚平.胆木注射液的质量研究［D］.武汉:华中科技大学，2008.