Survivin和Caspase-3蛋白表达与食管鳞癌放疗疗效的关系

郝辉 李娟 李亚辉

近年来随着分子生物学的发展，使我们能够从蛋白水平、分子水平深入认识食管癌的发生、发展和预后。存活素(Survivin)是近年研究较多的凋亡抑制蛋白，在大多数人类肿瘤中其表达增多，与肿瘤细胞的凋亡、增殖、血管生成及其预后和耐药性的产生密切相关［1－3］。半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)则是涉及细胞凋亡的最关键的蛋白酶［4］，在Caspase级联反应中，直接介导下游的凋亡效应。故本研究通过检测56例食管癌组织中Survivin和Caspase-3蛋白的表达，分析其表达的相关性、与食管癌临床分期及预后的关系，拟为临床治疗提供有益的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择河北医科大学第四医院2010年1月至2011年1月放疗前病理证实为食管鳞癌的内窥镜活检标本56例，全部患者均接受根治性放射治疗，放疗前后无其他辅助治疗，放疗采用6MV-X线直线加速器，肿瘤总剂量54～68 Gy，中位剂量60 Gy，2 Gy/次，1 次/d，5 d/周。其中男34 例，女22 例;年龄50～74岁，中位年龄65岁;胸上段10例，胸中段38例，胸下段 8例;病变长度≤5.0 cm 14 例，5.1 ～7.0 cm 20 例，7.1 ～10.0 cm 18例，＞10.0 cm 4例。依据2002年UICC食管癌国际 TNM 分期标准:全组患者 T1、T2、T3、T4 期分别为 2、38、14、2例;N0、N1期分别为38、18例;临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别为2、30、18、6 例。

1.2 检测方法 采用免疫组化SP法，1∶50浓度稀释的鼠抗人Survivin单克隆抗体，1∶75浓度稀释的鼠抗人Caspase-3单克隆抗体及IgG二抗工作液、SP试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。染色步骤参照试剂说明书完成。标本经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，5 μm连续切片，HE染色。

1.3 判断标准 光镜下观察阅片，双盲法计数阳性细胞，5个高倍视野(×200)计数取均值。Survivin阳性表达为胞浆或胞膜呈棕黄色颗粒，按Cai-De参考标准［5］:每个视野中均无着色细胞者或阳性细胞数＜25%者为阴性(－)，阳性细胞数≥25%者为阳性(+)(图1)。Caspase-3阳性表达为胞浆内出现棕黄色颗粒散在或弥漫片状分布，按Iseki标准［6］，根据 Caspase-3染色强弱及阳性细胞数两个方面综合判断Caspase-3标记指数:a染色强度(0=无，1=弱，2=中，3=强);b阳性细胞数(0=无阳性细胞，1=阳性细胞数＜25%，2=阳性细胞数25% ～50%，3=阳性细胞数 ＞50%)，a、b相加的综合得分即为Caspase-3阳性指数。用Caspase-3阳性指数大小来表示Caspase-3表达的高低:a+b得分为0～1，则阳性指数为0;a+b为2，则阳性指数为1;a+b为3，则阳性指数为2;a+b为4～5，则阳性指数为3;a+b为6，则阳性指数为4。综合记分＜2为阴性表达(－)，≥2为阳性表达(+)。见图2。

1.4 统计学分析 应用SPSS 11.5统计软件，计数资料采用χ2检验，蛋白表达指标之间及其与部分临床病理因素之间的相关关系采用Spearman等级相关检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 放射治疗后近期疗效评价 放射治疗后达到完全缓解者12例，完全缓解率(CR)为21.4%，部分缓解者44例，部分缓解率(PR)为79.6%，总有效率100%。疗后1年生存率61.4%，中位生存期14个月。观察期内已死亡16例，占28.6%(16/56)，其中复发7例，转移4例，呕血4例，心脏病1例。Survivin和Caspase-3蛋白表达对食管癌近期疗效无明显影响。

2.2 Survivin和Caspase-3蛋白表达及其与预后的关系 56例食管癌组织中Survivin和Caspase-3蛋白表达的阳性率分别为28.57%(16/56)、53.57%(30/56)，两者蛋白表达呈负相关(r= －0.549，P=0.002)。

Kaplan-Merier单因素分析结果显示:T分期、临床分期、病变长度、Survivin和Caspase-3蛋白表达均与患者预后相关，而性别、年龄、肿瘤部位、组织学分化程度与预后未显示出明显相关性。Survivin阴性表达者预后好于阳性表达者，Caspase-3阳性表达者预后好于阴性表达者(P ＜0.05)，见图3、4，表1。

2.3 食管癌临床分期与预后的关系 依据2002年UICC食管癌国际TNM分期标准，对56例食管癌患者进行临床分期，T1～2期40例患者预后明显好于T3～4期16例患者(P=0.001)(图5)。N分期对预后生存未显示出统计学差异。临床分期为Ⅰ～Ⅱ期32例患者较Ⅲ～Ⅳ期24例患者预后好(P=0.013)(图 6)。

2.4 多因素生存分析 将性别、年龄、病变长度、部位、淋巴结转移状态、照射剂量、病理类型、T分期、N分期、临床分期及Survivin和Caspase-3蛋白表达进行Cox多因素分析显示:Survivin蛋白表达、T分期、N分期与食管癌预后密切相关，Survivin蛋白阳性表达者及T、N分期较晚者预后差。见表2。

图1 Survivin蛋白在食管鳞癌中阳性表达(HE×200)

图2 Caspase-3蛋白在食管鳞癌中阳性表达(HE×200)

3 讨论

图3 Survivin蛋白表达与食管癌患者预后的关系

图4 Caspase-3蛋白表达与食管癌患者预后的关系

图5 T分期与食管癌患者预后的关系

图6 临床分期与食管癌患者预后的关系

表1 不同病理参数与食管癌患者预后的关系

表2 多因素分析对食管癌患者预后的影响

凋亡的抑制蛋白因子(inhibitur of apoptosis protein，IAP)是一类抑制凋亡的调节分子，其成员Survivin是近来发现的凋亡抑制基因，以细胞周期依赖的形式在G2/M期高表达，其过表达可促进有丝分裂致使细胞异常增殖［7］。Caspase蛋白酶又名半胱氨酸蛋白酶，是细胞凋亡的核心，根据在细胞凋亡级联反应中的作用位置可分为:在上游调控其他Caspase活化的始动Caspase(Caspase-1，2，4，5，8，9，10)和下游直接介导凋亡的效应Caspase(Caspase-3，6，7，14)，Survivin 可通过直接或间接作用于Caspase家族，从而阻断细胞的凋亡过程［8］。

近年来研究表明，Survivin在多种恶性肿瘤中高表达，而且其表达程度与肿瘤的发生、发展和预后密切相关［6］。Kato等［9］采用RT-PCR技术检测了51例食管癌中Survivin mRNA表达，显示癌组织中Survivin阳性表达率为70.9%，并且Survivin的表达与患者术后生存期显著相关，高表达者生存期短，提示Survivin表达增加有可能为判断食管癌预后的指标之一。Sarela等［10］在114例大肠癌的研究中发现，Survivin mRNA在肿瘤中表达阳性率高于癌旁组织，提示Survivin的表达在大肠癌的发生中有一定作用，同时Survivin的表达也与Ⅰ～Ⅲ期大肠癌患者的生存状态显著相关，低表达者生存期长。本研究亦显示阳性表达组预后差，这与多数研究结果一致。说明Survivin蛋白表达可以抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖，有可能成为食管癌预后不良的标志物。

Jiun-Yi等［11］采用免疫组化技术检测了40例食管癌手术标本Caspase-3表达，阳性表达率60%，5年生存率25%，阴性表达率40%，5年生存率6%(P=0.02)，多因素分析:肿瘤分期、分化程度、Caspase-3表达均可作为预后因素，推测Caspase-3蛋白表达可作为独立的评价食管癌预后良好的指标。陈洪雷等［12］应用免疫组化技术研究大鼠肺鳞癌Caspase-3蛋白表达水平与其细胞增殖间的关系，发现大鼠肺鳞癌Caspase-3阳性表达率44.12%，显著低于对照组正常大鼠支气管黏膜上皮细胞(P ＜0.01)及癌前病变组(P ＜0.05)，有可能Caspase-3参与了正常支气管黏膜上皮细胞的发育、转化及细胞凋亡过程的调节。本研究单因素分析亦显示Caspase-3阳性表达者预后差，与上述文献报道结果一致。Caspase-3缺失表达阻断了Caspase家族凋亡途径的下游效应因子，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞生长，从而赋予肿瘤细胞恶性增殖的生物学行为，Caspase-3蛋白表达可作为判断食管癌预后的指标。

本研究结果显示，随着Survivin在食管癌组织中表达量的升高或降低，Caspase-3的表达量呈升高或降低趋势，通过直线相关分析可以看到二者呈负相关，更证实了Survivin通过抑制Caspase活性，阻断细胞凋亡，故联合检测两者蛋白有望提高判断预后的价值。

虽然Survivin和Caspase-3在食管癌组织中的表达与食管恶性肿瘤的生物学行为和临床行为的关系及其作用机制尚不十分明了，但通过检测两者蛋白在食管癌中的表达，可能为临床治疗方案的选择和放射治疗疗效的评估提供一个参考标准。随着分子生物学研究的深入，多基因联合的基因治疗将会为食管恶性肿瘤的治疗开辟一个新的领域。

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3 Pennati M，Colella G，Folini M，et al.Ribozyme mediated attenuation of survivin expression sensitizes human melanema cells to cisplatin induced apoptosis.J Clin Invest，2002，109:285-286.

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5 Cai-De Lu，Dario C，Altieri，et al.Expression of novel antiapoptosis gene，survivin，correlated with tumor cell apoptosis and p53 accumulation in gastric carcinomas.Cancer Res，1998，58:1808-1812.

6 Iseki K，Tatsuata M，Uehara H，et al.Inhibitor of angiogenesis as a mechanism for inhibitor by 1α-hydroxyvitamin D3 and 1，25-dihydroxyvitamin D3 of colon carcinogenesis induced by azoxymethane in Wistar rat.Int J Cancer，1999，81:730-733.

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8 Shin S，Sung BJ，Cho YS，et al.An anti-apoptoric protein human survivin is a direct inhibitor of caspase-3 and-7.Biochemistry，2001，40:1117-1123.

9 Kato J，Kwwabara Y，Mitam M，et al.Expression of surviving in esophageal cancer:collelation with the prognosis and response to chemotheraphy.Int J Cancer，2001，95:92-95.

10 Sarela AI，Macadam RC，Farmery SM，et al.Expression of the antiapoptosisgene，surviving，predicts death from recurrent colorectal carcinoma.Gut，2002，46:645-650.

11 Jiun-Yi Hsia，Chih-Yi Chen，Jung-Ta Chen，et al.Prognostic significance of caspase-3 expression in primary resected esophageal squamous cell carcinoma.EJSO，2003，29:44-48.

12 陈洪雷，刁路明，陈福春，等.大鼠肺鳞癌Caspase-3基因表达水平与其细胞增殖核关系的研究.中国肺癌杂志，2002，5:440-443.