缺血预处理对局灶性缺血大鼠脑梗死区周围TLR4及GFAP表达的影响*

胡晓松，宋海星，刘 静，杨 拯，李 鑫

(成都医学院：1.基础医学实验教学中心；2.人体解剖学教研室,成都 610083)

近10年来人们对脑缺血临床治疗做了大量深入的研究，但真正能从基础研究应用到临床的神经保护治疗措施仍然甚少。脑缺血耐受(brain ischemic tolerance，BIT)是机体对损伤刺激固有的应激和防御反应，也是已知的内源性保护机制中作用最强大的。脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning，CIP)是指预先给予一个短暂、非致死性的轻度脑缺血打击之后，将对致死性的缺血产生耐受[1]，但其作用机制目前仍不甚明了。星形胶质细胞(astrocyte，AST)作为神经元最重要的功能伙伴，虽然近年来AST在脑缺血领域得到广泛关注，但有关其在BIT中的作用却一直未得到足够的重视。本实验通过研究 Toll样受体4(toll-like receptor4，TLR4)及胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)在CIP后脑缺血梗死区周围的表达变化,旨在探讨AST活化在BIT诱导机制中的可能作用。

1 材料与方法

1.1动物分组 健康SD 大鼠，雄性，清洁级，体质量250～300 g 共45只。大鼠随机分为：(1) CIP组，给予CIP 20 min,3 d 后给予大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO) 2 h,再灌注6、24、72 h；(2)MCAO组，未行CIP,单纯暴露动脉处的解剖结构20 min(假手术),余同CIP 组；(3)假手术组，两次均为假手术,均为暴露解剖结构,未进行缺血处理。每组各时间点5只。

1.2动物模型的制备 大鼠术前12 h禁食不禁水，以4%水合氯醛腹腔内注射麻醉(7.5 mL/kg)，置仰卧位，于颈部行长约25.0 mm常规纵行切口。暴露并钝性游离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，结扎ECA远侧端，动脉夹夹闭CCA近心端，在结扎线近端距分叉5 mm 处剪一约0.2 mm小口。用浸于2.5×106U/L肝素钠的长6 cm、直径0.26 mm、头端圆钝的尼龙线从ECA残端插入,经CCA分叉部进入ICA约(19.0±0.5)mm，直至感觉有阻力时，即阻断大脑中动脉(MCA)入口处，结扎ECA近端。20 min 后轻轻抽出栓线约10 mm形成第1 次再灌注,固定尼龙线并全层缝合切口。3 d后再次麻醉大鼠,找到ECA结扎处，重新剪口插线阻断MCA，结扎ECA的近心端，并留置尼龙线于体外,缝合皮肤。2 h 后抽出栓线,形成第2 次再灌注。

1.3神经病学评分及MCAO模型成功的判断标准 MCAO模型成功的纳入标准参照Longa 法[2]，0分：无神经功能缺损症状；1分:轻度局灶性神经功能缺损(不能完全伸展右前肢)；2分：中度神经功能缺损(向右侧转圈)；3分，重度神经功能缺损(向右侧倾倒)；4分，不能自发行走，意识水平降低。动物出现神经功能缺损，无烦躁不安、抬头狂体征，评分在1～3分者纳入。

1.4取材制片 大鼠脑缺血2 h、于再灌注预定时间点麻醉后，用生理盐水经主动脉快速冲洗至右心耳流出液变清亮，迅速断头取脑(摒弃蛛网膜下腔出血者)，立即置于-20 ℃冰箱冷冻10 min，用脑切片器按2 mm厚度切片，选取距前囟点(Bregma)约1.4～-0.6 mm的脑片行免疫组织化学染色。4%多聚甲醛固定12～24 h后行脱水、透明、石蜡包埋。切片厚度5 μm。

1.5固定、取材、切片 动物在麻醉后开胸，经升主动脉插管，先用生理盐水150 mL冲去血液，继而灌注含4%多聚甲醛的0.1 mol/L的磷酸缓冲液(pH7.4) 300 mL，注毕立即取脑组织行后固定6～24 h，石蜡包埋。

1.6免疫组织化学染色 免疫组织化学采用即用型二步法，TLR4(1∶200，Abcam公司)及GFAP(1∶500，Chemicon公司)，二步法试剂PV-6002由北京中杉金桥生物公司(美国Zymed公司分装产品)提供。阴性对照用正常血清代替一抗。

1.7图像分析及统计学处理 阳性表达为结构完整、定位明确的着色较深(棕褐色)的细胞。切片在统一放大倍数(×400)下，随机选6个视野，输入Image pro-plus6.0图像分析系统，记取平均阳性细胞数。实验结果行方差分析，两两比较采用q检验。

2 结 果

2.1各组大鼠脑梗死灶周围GFAP的表达 镜下GFAP阳性细胞可见两种类型，一种胞核肿胀、突起粗短、深染，主要分布于梗死区周围；另一种突起长而纤细，主要分布于缺血侧胼胝体、非缺血侧脑组织。此外，小血管和微血管壁，脑室脉络膜和室管膜上皮亦有表达。假手术组GFAP表达较少，且较弱，少量小血管和微血管内皮细胞呈阳性反应。再灌注6 h，即见GFAP明显表达，并随再灌注时间延长，有表达逐渐增强的趋势，再灌注72 h达到峰值。在缺血梗死区周围GFAP阳性细胞呈围绕梗死区的多层分布，突起深染、粗短，少数突起伸长、交织(彩插Ⅱ图1)。此外，侧脑室背外侧角可见较多沿胼胝体长轴平行排列的GFAP阳性细胞，突起较长，多伸向缺血梗死区。与MCAO组比较，同时间段CIP组GFAP阳性细胞数目明显较多(P<0.05)。据观察再灌注对照侧室管膜下区、纹状体、胼胝体等部位亦有GFAP胶质细胞样表达，但数目较缺血侧明显减少见图2。

2.2各组大鼠脑梗死灶周围TLR4的表达 TLR4阳性细胞主要表达于缺血侧纹状体、胼胝体、大脑皮质等处的神经胶质细胞、神经元及炎细胞等处。假手术组仅见微血管壁及脉络丛上皮、室管膜上皮等处的弱表达，TLR4阳性表达产物在细胞质。再灌注6 h起，在MCAO组，即见TLR4明显表达，并达高峰。再灌注72 h组梗死灶周围见较多成簇分布、体积增大胞浆较淡的小胶质细胞，即格子细胞(gitter cell)，多数胞浆中有TLR4颗粒状表达。此外，TLR4胶质细胞样阳性细胞可见核肿胀及较短突起，颗粒细胞及锥体神经元均见TLR4的胞浆表达(彩插Ⅱ图3)。CIP组TLR4与相应时间段MCAO组比较，均明显下降(P<0.05)，见图4。随再灌注时间延长，TLR4表达逐渐降低。

*：P<0.05，与MCAO组比较。

*：P<0.05，与 MCAO组比较。

3 讨 论

脑缺血后，炎症反应是神经元死亡的重要机制，并贯穿整个脑缺血损伤的始终[3]。TLR4 作为门户蛋白启动机体的炎症链式反应，在跨膜信号转导受体家族TLRs 中占有重要的位置[4]。研究表明，TLR4主要通过识别结合细菌LPS、HSPs、HMGB1、透明质酸等配体介导MyD88依赖和TRIF依赖的信号转导通路，从而诱导IL-1、IL-6、IL-12、IL-8、IL-10、TNF-α及 IFN-γ、MMP-9、iNOS、COX-2等与脑缺血密切相关的炎性介质的释放[5-6]。

CIP可激发机体内源性神经保护机制，从而减轻脑缺血再灌注损伤的严重程度。本实验结果显示，与假手术组比较，CIP组及MCAO组的TLR4表达均于缺血再灌注早期(6 h)即达峰值，并随再灌注时间延长呈下降趋势；与MCAO组比较，同时间段CIP组TLR4阳性细胞数目均显著，结果证实预先给予一次短暂的CIP即可在脑缺血损伤早期抑制TLR4介导的炎性信号通路的过度活化。此外，本研究结果表明，TLR4主要表达于缺血侧纹状体、胼胝体、大脑皮质等处，阳性细胞主要为小胶质细胞，与Laflamme和Rivest[7]报道结果不同的是，本实验还发现TLR4在以上脑区的神经元和AST表达，该结果与Tang等[8]报道的一致。作为非传统意义上的炎性反应细胞，神经元和AST表达炎性信号蛋白分子，的确使人费解。有研究发现[9]，神经元TLR4激活后，可引起P38-JNK/AP-1通路活化、炎性因子释放、脂质过氧化、凋亡等损伤过程，而TLR4缺陷小鼠的皮质神经元在体外糖剥夺培养中有更高的生存率[8]，结果表明神经元自身分布的TLR4对其存活有重要影响。

生理状态下，AST在提供CNS代谢和营养支持、维持正常神经元功能、参与血脑屏障、调节突触活性等方面发挥重要作用[10-12]。脑缺血后，兴奋性谷氨酸释放、胞外离子失衡、即早基因(c-fos、c-jun 等)的表达上调等因素引起AST的广泛激活并表达其标志蛋白GFAP，活化的AST向神经元传递乳酸盐、丙酮酸盐、糖原等能量物质，并积极清除细胞外兴奋性氨基酸，从而发挥微调节神经元微环境作用。此外，AST还可通过合成NGF、减少自由基形成、抑制白细胞和血小板的黏附聚集、抑制细胞凋亡、减少钙超载等效应，以及参与神经元突触的生成等环节发挥神经保护和促神经修复的作用[13]。本研究结果显示，无论CIP组还是MCAO组，随着再灌注时间延长，脑梗死灶周围GFAP的表达均有增加趋势，与MCAO组比较，同时间段CIP组GFAP阳性细胞数目明显较多，鉴于AST在神经元保护中的重要作用，有理由相信这种早期CIP引发的AST活化参与了BIT的发生过程。同时，本实验也提示GFAP表达上调的激发与维持并不完全依赖TLR4信号通路的活化，该过程是否有其他TLRs(如TLR2、TLR9)参与、AST的GFAP表达增强与其神经保护功能的具体机制等问题尚需进一步研究。

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