前列腺素E2对结肠癌细胞CacyBP/SIP核转位的影响*

谢福利，翟惠虹

(1.宁夏师范学院医学院，银川 756000；2.宁夏医科大学总医院消化内科，银川 750004)

20世纪70年代研究发现大肠癌患者体内前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)含量是其它肿瘤的1.7～5.0倍[1]。80年代应用非甾体消炎药可降低结肠癌40%～50%发病率[2]。PGE2异常升高与肿瘤的关系密切，促进结肠癌的进展[3]。钙周期素结合蛋白(calcyclin-binding-protein，or siah-1 interacting protein,CacyBP/SIP)自1996年发现以来，越来越多的证据显示[4-5]：CacyBP/SIP在肿瘤发生、发展、侵袭、转移等方面都有重要的作用；同时，CacyBP/SIP具有依赖Ca2+浓度的核转位现象[6]。PGE2是否可诱导CacyBP/SIP核转位，由此促进结肠癌细胞增殖？本研究拟通过构建CacyBP/SIP过表达慢病毒颗粒，转染至结肠癌细胞，给予PGE2刺激，观察CacyBP/SIP在结肠癌细胞中的定位，明确PGE2是否诱导CacyBP/SIP核转位。

1 材料与方法

1.1材料 结肠癌细胞SW480购于上海中科院。小牛血清、L15培养基、胰酶购自Gibco公司；CacyBP/SIP mAb购于Cell signaling；PGE2购于Cayman公司；胞浆胞核蛋白抽提试剂盒购于pierce公司；DAPI染色剂购于Sigma公司； FITC标记的羊抗鼠IgG为中山公司产品；Triton x-100裂解液试剂盒为北京鼎国公司；293T细胞、pGC-LV重组载体、pHelper 1.0、pHelper 2.0来源于吉凯基因公司；PVDF膜购自Merck公司；其他相关试剂购自Takara、Fermentas、SinoBio、NEB、捷瑞公司。

1.2方法

1.2.1过表达慢病毒载体构建 应用人结肠癌细胞株HCT-116的cDNA序列，采用Primer Premier v5.0软件设计上游和下游引物，PCR法扩增，分别用Nhe I和EcoR I进行双酶切，T4 连接酶将酶切后的产物相连，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，PCR法筛选阳性克隆，接种阳性转化子，送测序。慢病毒包装、采用逐孔稀释法测定并标定病毒滴度。

1.2.2转染人结肠癌细胞SW480细胞 用含10%的56 ℃、30 min热灭活小牛血清的L15培养基，在37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，隔天换液，待细胞长至80%～90%传代。至细胞在T50瓶长至30%～50%时，每瓶加入500 μL(5 μg/mL)Polybrene、4 400 μL完全培养基和100 μL(1×108)过表达CacyBP/SIP的慢病毒颗粒，在水平方向轻轻摇动培养瓶，使其充分混匀，放入培养箱培养8～12 h以后观察细胞状态，更换为新鲜培养基继续培养。

1.2.3激光共聚焦和Western blot检测 正常消化传代并行激光共聚焦检测。再取3个12孔培养板，每孔放置一个细胞爬片，每孔接种(3～4)×104细胞于12孔板。至细胞长至最佳状态时，吸干培养基，用PBS冲洗2次，每个培养板加入2 mL含100 μmol/L PGE2培养基，对照组每孔分别加入完全培养基作为对照。放入培养箱培养1 h。固定、打孔、用含DAPI封片剂染色封片。激光共聚焦检测CacyBP/SIP在细胞中的定位。Western blot法检测：分别取转染后的SW480细胞，在给予100 μmol/L PGE2刺激前、后1 h，分别抽提胞浆、胞核蛋白，用BCA定量；上样缓冲液稀释至5 μg/uL、煮沸后-80 ℃冻存；把20 μL蛋白样品上样到12%SDS-PAGE胶加样孔内，电泳电压80 V，时间20 min；湿式转膜，电流200 mA，60 min；加入5%脱脂牛奶封闭60 min后，加入CacyBP/SIP单抗(1∶200)4 ℃孵育过夜，常规洗膜后加入羊抗鼠IgG(1∶2 000)的二抗，室温孵育1 h，洗涤。曝光、显影。

2 结 果

2.1激光共聚焦检测PGE2刺激前、后CacyBP/SIP 在细胞内定位和表达 无PGE2刺激条件下 CacyBP/SIP 主要位于细胞胞质内，给予100 μmol/L PGE2刺激1 h条件下CacyBP/SIP可转位至细胞核内(图1)；100 μmol/L PGE2刺激0.5 h条件下CacyBP/SIP无明显核转位(图2)。

a：白光下细胞；b：未给予PGE2刺激CacyBP/SIP位于胞浆；c：DAPI染色；d：重叠图像显示CacyBP/SIP位于胞浆；e：白光下细胞；f：给予PGE2刺激 CacyBP/SIP进入胞核；g：DAPI染色；h：重叠显示CacyBP/SIP位于胞核。

a：白光下细胞；b：CacyBP/SIP；c：DAPI染色；d：重叠图像显示。

-:表示无刺激;+:有刺激;C:胞浆;N:胞核。

2.2Western blot检测PGE2刺激前、后CacyBP/SIP在细胞内定位和表达 无刺激条件下，CacyBP/SIP主要在胞质内表达，给予100 μmol/L PGE2刺激1 h，可在细胞核内表达(图3)。

3 讨 论

1996年Filipek从小鼠腹水瘤细胞和鼠脑组织中首次发现一个以依赖Ca2+浓度，可与S100 A6结合，命名为 Calcyclin(S100A6)-binding-protein(钙周期素结合蛋白)，既CacyBP。2001年在研究p53刺激下β-catenin泛素化降解新通路时，从cDNA文库中调到一个可以与Siah-1相互作用的蛋白，命名为 Siah-1-interacting-protein，即SIP。进一步研究发现，SIP即CacyBP，因此，目前命名为CacyBP/SIP。其相对分子质量约26×103，含一个687 bp的开放阅读框，编码228个氨基酸，存在7个磷酸化位点和1个核定位信号[7]。

目前，对CacyBP/SIP功能研究较少，其功能主要表现在：(1)与p53有关：参与了新的泛素-蛋白酶体降解，当p53在细胞内表达升高时，可诱导Siah-1基因的表达，共同组成泛素连接酶复合体(Siah-1-CacyBP/SIP-SCF)，将未被磷酸化的β-catenin蛋白酶体降解；(2)与红细胞有关[8]：有报道促红细胞生成素受体活化可促进CacyBP/SIP表达上调。

以往研究发现， CacyBP/SIP在胃癌阿霉素耐药细胞中高表达[9]并参与胃癌细胞多重耐药,其下调可以部分逆转耐药性[10]。在肾细胞癌中发现：CacyBP/SIP表达上调能抑制肾细胞癌的增殖和肿瘤形成[11]。近年来又发现CacyBP/SIP参与乳腺癌、胰腺癌的发生、发展及复发转移，可能成为预后不良的生物学指标之一[12-14]。因此，推断CacyBP/SIP与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。

本课题组前期利用淋巴细胞杂交瘤技术制备了3株CacyBP/SIP单克隆抗体，对正常及肿瘤组织中CacyBP/SIP表达分布状况做了较系统的研究，研究发现[15-16]：CacyBP/SIP在结肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织，在正常结肠组织不表达，且主要定位于胞浆及胞核；给予给KCl刺激后，通过升高胞浆内Ca2+浓度，可诱导CacyBP/SIP核转位。

2002年Filipek等[6]首次发现CacyBP/SIP具有依赖Ca2+浓度的核转位现象，那么，究竟哪些因素可以引起CacyBP/SIP核转位？

PGE2在生理状态下含量很低，却又具有很强的生理活性。环氧酶-2(COX-2)是 PGE2合成的限速酶，应用非甾体消炎药降低结肠癌发病率主要是通过抑制COX-2活性达到治疗作用，选择性COX-2抑制剂成为结肠癌防治的一条新途径。PGE2异常升高与肿瘤的关系密切：直肠癌PGE2含量与肝肺转移呈正相关；大肠癌PGE2含量和肿瘤大小呈正相关，并且Dukes′D期明显高于B、C期；PGE2能显著促进结肠癌细胞的生长；PGE2含量与肿瘤分化程度呈正相关；结肠癌化疗中用其抑制剂提高了患者生存率[18]。

本研究通过CacyBP/SIP过表达慢病毒颗粒转染至结肠癌SW480细胞，激光共聚焦显微镜发现CacyBP/SIP主要位于细胞胞浆，Western blot亦证实其位于胞浆。给予PGE2刺激发现CacyBP/SIP可发生核转位现象，Western blot亦证实CacyBP/SIP在刺激前位于胞浆，刺激后位于胞核。蛋白在细胞中的定位常常与其功能密切相关， CacyBP/SIP在给予刺激后发生核转位及磷酸化，提示其可能做为信号分子传递信息，从而参与细胞功能的调节。作者前期已发现CacyBP/SIP在结肠癌中高表达，免疫组化结果提示CacyBP/SIP位于胞浆及胞核，PGE2可诱导CacyBP/SIP核转位，CacyBP/SIP是否作为信使，传递上游促进恶性肿瘤增殖的信号，需进一步研究。

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