两株嗜酸乳杆菌体外降低胆固醇的研究

路四海 赵瑞香 祁婷婷

（河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003）

两株嗜酸乳杆菌体外降低胆固醇的研究

路四海 赵瑞香 祁婷婷

（河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003）

考察两株嗜酸乳杆菌体外降低胆固醇的降低曲线和降低方式，以及不同条件下嗜酸乳杆菌对培养基中胆固醇的降低情况。结果表明，这两株菌对胆固醇有明显的去除作用，其对胆固醇的降低作用是同化吸收和共沉淀的结果，以同化方式为主；随着接种量的增加，降低率也随之增加；不同胆盐对其降低胆固醇效果不同，当胆盐添加量为0.2%（m/V）时，胆固醇降低量最大；当吐温80添加量为0.1%时，胆固醇降低效果最佳。

嗜酸乳杆菌；胆固醇；降低率

胆固醇（cholesterol）是一种具有环戊烷多氢菲的27碳化合物，为人类生存所必需的营养成分，具有重要的生理功能，它既是构成细胞膜的重要成分，又可在体内转化形成类固醇激素，并且是合成维生素D3的原料及胆汁酸的前体［1，2］。但是如果体内积累过多的胆固醇也会对人体造成危害。大量的试验研究［3］表明，嗜酸乳杆菌等乳酸菌能够有效地降低血清及培养介质中的胆固醇，并且嗜酸乳杆菌是一类具有益生作用的微生物，广泛用于食品工业中。因此，开发出具有降低胆固醇保健作用的嗜酸乳杆菌食品具有很广阔的市场前景。

本试验就两株嗜酸乳杆菌对体外胆固醇降低作用和方式，以及不同因素对其降胆固醇的影响进行了研究，以期对嗜酸乳杆菌保健食品的开发利用提供一定的理论基础。

1 材料及方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilusind－1和ind－2（简写为la1和la2）：由波兰罗兹技术大学食品化学与生物工程学院发酵工程与工业微生物系提供，河南科技学院食品学院分离、纯化和保藏。使用前用MRS培养基活化，以4%的接种量在37℃培养20h，活化两次以备试验使用。菌株在实验过程中置于4℃冰箱保存。

1.1.2 培养基

MRS培养基［4］：蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，琼脂粉10g，吐温 80 1mL，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，K2HPO42g，蒸馏水1 000mL调pH 6.2～6.4，121℃灭菌15min。

1.1.3 主要试剂

牛磺胆酸钠：美国Sigma公司；

总胆固醇测定试剂盒：长春汇力生物技术有限公司；

胆酸、牛胆盐：化学纯，北京奥博生物技术有限责任公司；

胆固醇等其他试剂：均为分析纯。

1.1.4 主要仪器

生化培养箱：SHP－250型，上海三发科学仪器有限公司；

超净工作台：SW－CJ，苏净集团安泰公司；

高速冷冻离心机：RC5C，美国杜邦公司；

手提式不锈钢蒸汽消毒器：XY－280A，上海三申医疗器械有限公司；

可见分光度计：7200型，尤尼克（上海）仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 含胆固醇 MRS（简写为 MRS－CHOL）培养基的配制

准确称取胆固醇1g，以无水乙醇定容至100mL，即可获得10mg/mL的胆固醇溶液，使用前用0.45μm滤膜过滤。在灭菌过的MRS液体培养基中添加1%上述溶液，使胆固醇终浓度为100μg/mL。

1.2.2 胆固醇降低曲线及方式的测定 将活化后的la1和la2以体积分数为4%的接种量接种于含有0.1%牛胆盐的MRS－CHOL培养基内，置于37℃下培养，每隔4h取1次样，于4℃6 000r/min下离心15min测其上清液胆固醇含量，沉淀用同体积的pH 6.8的磷酸盐缓冲液洗涤两遍，同样条件离心，得到的上清液为沉淀洗涤液用于胆固醇测定。

1.2.3 接种量对嗜酸乳杆菌降低胆固醇作用的影响 将活化后的la1和la2分别以1%，2%，3%，4%，5%的接种量接种于牛胆盐含量为0.1%的 MRS－CHOL液体培养夜内，37℃ 条件下培养24h后，于4℃6 000r/min下离心15min测其上清液胆固醇含量，计算其胆固醇降低率。

1.2.4 胆盐种类对嗜酸乳杆菌降低胆固醇作用的影响

将活化后的la1和la2以4%的接种量分别接种于含胆盐量为0.1%的胆酸、牛磺胆酸钠、牛胆盐 MRS－CHOL液体培养液中，37℃条件下培养24h后，于4℃6 000r/min下离心15min测其上清液胆固醇含量，计算其胆固醇降低率。

1.2.5 胆盐添加量对嗜酸乳杆菌降低胆固醇作用的影响

将活化后的la1和la2以4%的接种量分别接种于含牛胆盐为 0%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5% （m/V）的MRS－CHOL培养液内，37℃条件下培养24h后，于4℃6 000r/min下离心15min测其上清液胆固醇含量，计算其胆固醇降低率。

1.2.6 吐温80添加量对嗜酸乳杆菌降低胆固醇作用的影响 将活化后的la1和la2以4%的接种量接种于牛胆盐含量为0.1%，吐温80含量分别为0.05%，0.10%，0.15%，0.20% 的 MRS－CHOL液体培养液中，37℃ 条件下培养24h后，于4℃6 000r/min下离心15min测其上清液胆固醇含量，计算其胆固醇降低率。

2 结果与讨论

2.1 胆固醇降低曲线及方式的测定

Liong M T等［5］认为胆固醇的去除与菌体的生长有密切关系。而本试验得到了相似的结果，见图1。

图1 la1和la2的胆固醇降低曲线Figure 1 The removal curve of cholesterol by la1and la2

在la1和la2培养的初期（0～8h），细菌正处于生长的延滞留期，菌体生长缓慢，而且菌体数量也相对较低，因此胆固醇降低率也低，但随着培养时间的延长（8～24h），菌体生长活跃，活菌数急速增加，菌体进入了对数生长期，细菌上清液中的胆固醇含量急剧下降，在24h附近达到了最大值，la1和la2对胆固醇的降低率分别达到了53.11%和42.92%。而在培养的末期（24～32h），胆固醇降低率略有下降，这可能是由于在菌体生长的后期，一部分菌体死亡后，菌体裂解将胆固醇释放出来的结果［6］。

为了进一步考察la1和la2对胆固醇的降低方式，对培养24h的菌体用pH 6.8的磷酸盐缓冲液进行洗涤，得到了沉淀洗涤液，作为其与胆固醇的共沉淀率，同化率为胆固醇降低率与共沉淀率之差，结果见图2。

图2 la1和la2的降胆固醇方式Figure 2 The removal ways of cholesterol by la1and la2

由图2可知，la1和la2对胆固醇的同化率要明显高于共沉淀率，其中同化率分别为42.13%和37.05%，而共沉淀率仅为10.59%和5.37%。因此，la1和la2对胆固醇的降低作用是以同化为主的多方面共同作用的结果。

2.2 接种量对嗜酸乳杆菌降低胆固醇作用的影响

菌种接种量对发酵产品的品质有重要的影响，特别是发酵乳类产品，考虑到菌株的应用及对发酵产品pH值的要求，一般接种量为1%～5%［7］。

由图3可知，随着接种量的增加，两株菌对胆固醇的降低率也随之增大；但接种量超过3%时，其增速放缓，当接种量达到5%接种量时解率都达到各自最高值，la1降低率高达58.63%，而la2也达到了47.97%。对于各菌株而言，在不同接种量条件下，la1菌株的降低率一直保持最高。

图3 接种量对la1和la2降胆固醇的影响Figure 3 The influence of different inoculation amounts on the cholesterol－reducing by la1and la2

2.3 胆盐种类对嗜酸乳杆菌降低胆固醇作用的影响

Klaver等［8］提出细菌从培养基中去除胆固醇是游离胆酸和胆固醇在pH低于5.5时共同沉淀的结果，乳酸菌产生的胆盐水解酶（BSH），通过水解结合型胆盐转变为游离胆酸，因后者的溶解度降低与胆固醇发生共同沉淀作用。因此，培养基中的胆盐存在与否，胆盐的结合状态都会影响乳酸菌的降胆固醇作用。试验选用3种不同类型的胆盐来研究胆盐对la1和la2降胆固醇作用的影响。

图4 la1和la2在不同胆盐培养基中的降胆固醇能力Figure 4 Cholesterol removal in different bile salts by la1and la2

由图4可知，la1和la2在同一胆盐培养基内的降胆固醇能力不同，并且同一菌株在不同胆盐存在下，表现的降胆固醇能力也是不同的，但无论在哪种胆盐下，la1对胆固醇的降低能力都要高于la2。la1和la2对脱结合型胆盐－游离胆酸培养基的降胆固醇作用最强，分别为56.54%和48.24%；其次为混合型胆盐－牛胆盐，降低率为52.18%和43.12%；纯结合型胆盐－牛磺胆酸钠最低，但也达到了38.19%和34.37%。由于胆固醇只能在pH低于5.5时与脱结合型的胆盐发生共沉淀作用，因此，从两株菌在牛磺胆酸钠培养基内对胆固醇的降低能力也侧面反映了其产胆盐水解酶（BSH）的能力。

2.4 胆盐添加量对嗜酸乳杆菌降低胆固醇作用的影响

由图5可知，在没有胆盐的存在下，la1和la2对胆固醇也有较好的降低作用，胆固醇降低率分别为40.37%和36.85%。当培养基内添加不同含量的胆盐后，菌株对胆固醇的降低能力呈现先升高后降低的趋势，在胆盐添加量为2%时，胆固醇降低率达到最大，分别为54.28%和43.35%，而后，随着胆盐浓度增加，降胆固醇作用逐渐降低。这可能是适当浓度的胆盐不但可以与胆固醇发生共沉淀作用，而且还能增加细胞膜通透性利于胆固醇的同化作用［9］，然而随着胆盐浓度的提高，抑制了菌体的生长，导致其降胆固醇作用的下降。

图5 胆盐添加量对la1和la2降胆固醇的影响Figure 5 The influence of theaddition of bile salt on cholesterol－reducing by la1and la2

2.5 吐温80添加量对嗜酸乳杆菌降低胆固醇作用的影响

吐温80既是一种乳化剂，又是乳酸菌的生长刺激因子，对乳酸菌的生长有非常重要的作用。在培养基内添加不同浓度的吐温80，其结果见图6。

图6 吐温80添加量对la1和la2降胆固醇的影响Figure 6 The influence of different dosages of tween80 on cholesterol removal by la1and la2

由图6可知，吐温80含量低于0.1%时，la1和la2对胆固醇的降低作用呈上升趋势，当含量为0.1%时，降低率达到最大值，分别为52.36%和44.19%，当含量超过0.1%后，随着含量的增加降低率呈现下降趋势。其原因可能是，在低浓度时，吐温80可以刺激菌株的生长，同时对培养基内胆固醇进行乳化作用，使胆固醇可以均匀的分散于培养基内，增大了与菌体的接触面积，更有利于对胆固醇的同化吸收；但是过高的吐温80含量又会被菌体代谢利用，作为细胞膜脂质的组成成分，进而改变细胞膜的特性（弹性、流动性、柔韧性等），使细胞膜的通透性降低［10，11］，进而影响了菌体对胆固醇的同化吸收作用。

3 结论

通过本试验可知，嗜酸乳杆菌la1和la2对胆固醇均有良好的降低作用，但la1的降低率（53.11%）要明显高于la2（42.92%）。在培养过程中，嗜酸乳杆菌la1和la2对胆固醇的降低率受培养时间、菌种接种量、胆盐种类及添加量、吐温80添加量等多种因素的影响。此外，在试验中还发现嗜酸乳杆菌la1和la2对胆固醇的降低作用是以同化方式为主的多方面的结果，但是对同化作用的具体的过程及是否存在某种关键物质等问题还不是很清楚，还需要进一步的深入研究。虽然嗜酸乳杆菌体外与体内降低胆固醇的方式有很大不同，但是通过对其体外降低胆固醇作用的研究，可以为嗜酸乳杆菌保健食品的开发与应用提供一定的理论基础。

1 任邦哲，蒋中俊.生物化学与临床医学［M］.长沙：湖南科学技术出版社，1993：202～206.

2 刘娟.植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株降胆固醇机理的研究［D］.上海：上海海洋大学，2008.

3 Ooi L G and Liong M T .Cholesterol－lowering effects of probiotics and prebiotics：a review of in vivo and in vitro findings［J］.Int.J.Mol.Sci.，2010，11（6）：2 499～2 522.

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5 Liong M T，Shah N P.Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of Lactobacilli strains［J］.J.Dairy Sci.，2005，88：55～66.

6 赵瑞香.嗜酸乳杆菌及其应用研究［M］.北京：科学出版社，2007：72～74.

7 尹军霞，沈国娟，谢亚芳.分离自酸菜汁的乳酸乳球菌体外去除胆固醇特性［J］.食品与生物技术学报，2009，28（6）：1～5.

8 Klaver E A K，Van Der Meer R.The assumed assimilation of cholesterol by Lactobacilli and Bifidobacterium bifidum is due to their bile salt deconjugation activity［J］.Applied and Environmental Microbiology，1993，59：1 120～1 124.

9 张旻.降胆固醇功能乳杆菌的筛选及降解机理研究［D］.上海：上海交通大学，2006.

10 闫学会，张兰威，冯镇，等.吐温80对液氮冷冻处理的双歧杆菌的冻伤保护［J］.食品工业科技，2006，27（9）：75～80.

11 Noh D O，Kim S H，Gilliland S E.Incorporation of cholesterol into the cellular membrane ofLactobacillus acidophilusATCC 43121［J］.J.Dairy Sci.，1997，81（7）：1 818～1 824.

Study on cholesterol removal by twoLacto b acillus acidophilusstrains

LU Si－hai ZHAO Rui－xiangQI Ting－ting

（Food College，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang，Henan453003，China）

The removal curve and ways of cholesterol of twoLactobacillus acidophilusstrains were investigated，and the effect of different culture conditions on cholesterol reduced by two strains were also studied in vitro.Both of two strains showed a significant ability to reduce cholesterol，which was due to both bacterial assimilation and precipitation of cholesterol，mainly bacterial assimilation；as inoculation amount increased，the reduction rate increased；the effect of various bile salts on cholesterol reduction were different，the maximum amount of cholesterol reduction could be reached when the addition of bile salt was 0.2% （m/V）；the effect of cholesterol reduction was best when the dosage of 0.1%tween 80.

Lactobacillus acidophilus；cholesterol；reduction rate

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.014

路四海（1985－），男，河南科技学院在读硕士研究生。E－mail：lusihai123＠126.com

2011－08－01