超临界CO2流体萃取苦瓜叶中黄酮的研究

王文渊唐守勇龙红萍

（1.湖南永州职业技术学院，湖南 永州 425000；2.中南大学药学院，湖南 长沙 410013）

超临界CO2流体萃取苦瓜叶中黄酮的研究

王文渊1唐守勇1龙红萍2

（1.湖南永州职业技术学院，湖南 永州 425000；2.中南大学药学院，湖南 长沙 410013）

研究超临界流体萃取苦瓜叶黄酮的影响因素，并对提取工艺进行优化设计。在单因素试验和正交试验的基础上，得到超临界萃取工艺的最优化条件：以用量为1∶1（V∶m）的95%乙醇浸润1h，夹带剂体积与原料质量比2∶1，CO2流量22L/h、萃取压力28MPa、萃取温度44℃，萃取时间150min。该工艺条件下，黄酮的提取率可达到3.69%。

超临界；苦瓜叶；黄酮；提取

苦瓜又名癞葡萄、凉瓜，因有特殊苦味而得名，研究［1－4］表明，苦瓜的果实和茎叶中富含黄酮；苦瓜黄酮具有抗癌防癌、降血糖、血脂、抗心律失常和增强免疫力等有多种生理和药理功效，因其独特的功效可作为治疗心脑血管疾病的药物［5］。苦瓜黄酮还具有清除自由基抗氧化和抗衰老作用［6］，是一种天然的抗氧化剂，可用作为食品中的天然添加剂［7］，在医药和食品领域中有着广泛的用途。目前，对苦瓜中的多糖、皂苷等生物活性成分研究的较多，而对苦瓜茎叶中黄酮类物质研究报道的较少。

超临界CO2萃取作为近年来发展的一种集萃取、分离于一体的新兴提取技术，具有提取条件温和、活性成分不易被破坏、消耗少、传质速率快、溶剂残留少等优点［8］，且最终的提取效率和经济性同水提法、有机溶剂提取法、微波法、超声波法等常规方法相比也有很大提高，被广泛应用在天然产物有效成分的提取中［9］。本试验以苦瓜叶为原料，先用乙醇进行浸润预处理，然后采用超临界流体萃取技术提取其中黄酮，并与固体直接进料方式的试验结果进行比较，以期得到更高效的提取苦瓜叶中黄酮类化合物的工艺。为充分利用苦瓜叶中的生物活性物质－苦瓜黄酮，提供一定的理论基础和指导。

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

苦瓜叶，采自永州市农科所蔬菜园区，干燥粉碎，过40目筛，装瓶备用；

CO2（纯度≥99.5%）：食品级，永州市医用氧气厂；

芦丁对照品：批号100080，中国药品生物制品检定所；

无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠等试剂：均为国产分析纯；

二次蒸馏水：本实验室自制；

超临界萃取装置：HA221－40，江苏南通华安超临界萃取有限公司；

紫外－可见分光光度计：UV－9100，上海民仪电子有限公司；

高速万能粉碎机：FW－100型，天津市泰斯特仪器有限公司；

电子天平：AEU－210，湘仪天平仪器设备有限公司；

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

苦瓜叶→干燥→粉碎→称量→乙醇浸润→超临界萃取→合并萃取物→减压浓缩→黄酮提取液

1.2.2 操作要点

（1）原料预处理：新鲜苦瓜叶经漂洗、阴干，于65℃烘箱内干燥12h后取出，粉碎，过40目筛。称取50.0g苦瓜叶粉于250mL三角瓶中，按用量为1∶1（V∶m）加入95%乙醇浸润1h。

（2）超临界CO2流体萃取：将经过乙醇浸润的苦瓜叶粉通过料筒装入萃取釜，以95%乙醇为夹带剂，按预定的设计调节CO2流量、萃取釜的压力和温度，设定分离釜I压力8MPa，温度40℃，分离釜Ⅱ压力6MPa，温度45℃，萃取一定的时间，每隔30min收集萃取物，合并萃取物，减压浓缩得样品溶液。

1.2.3 黄酮提取的单因素试验

（1）夹带剂及其用量的确定：使用加夹带剂可提高苦瓜黄酮的提取率，根据前期预试验结果，并考虑安全性、成本等因素，确定以95%的乙醇作为夹带剂。再固定CO2流量20L/h，萃取压力25MPa，萃取温度50℃，萃取时间150min，夹带剂的用量分别控制为1∶1，1.5∶1，2∶1，2.5∶1，3∶1（V∶m），以黄酮提取率为评价指标，考察夹带剂用量对黄酮提取率的影响。

（2）萃取压力对黄酮提取率的影响：以95%的乙醇作为夹带剂，固定 CO2流量20L/h，温度50℃，夹带剂用量2∶1（V∶m），萃取时间120min，萃取压力分别控制为16，18，20，22，24，26，28，30，32MPa，以黄酮提取率为评价指标，考察萃取压力对黄酮提取率的影响。

（3）萃取温度对黄酮提取率的影响：以95%的乙醇为夹带剂，固定CO2流量20L/h，压力22MPa，时间120min，夹带剂用量2∶1（V∶m），萃取温度分别控制为32，34，36，38，40，42，44，46，48，50℃，以黄酮提取率为评价指标，考察萃取温度对黄酮提取率的影响。

（4）萃取时间对黄酮提取率的影响：以95%的乙醇为夹带剂，固定CO2流量20L/h，温度44℃，压力28MPa，夹带剂用量2∶1（V∶m），萃取时间分别控制为60，90，120，150，180，210，240min，以黄酮提取率为评价指标，考察萃取时间对黄酮提取率的影响。

（5）CO2流量对黄酮提取率的影响：以95%的乙醇作为夹带剂，固定温度44，压力28MPa，时间150min，夹带剂用量2∶1（V∶m），CO2流量分别控制为15，18，21，24，27，30，33L/h，以黄酮提取率为评价指标，考察CO2流量对黄酮提取率的影响。

1.2.4 正交试验设计方案 根据各单因素试验结果确定正交试验的因素及水平取值范围，再设计L9（34）正交试验，以黄酮提取率为评价指标，进一步优化苦瓜叶黄酮的超临界CO2流体萃取工艺参数。

1.2.5 总黄酮含量的测定

（1）标准曲线的绘制：采用 NaNO2－Al（NO3）3化学络合分光光度法［10］，以芦丁对照品溶液做标准曲线，求得回归方程：

式中：

A——吸光度；

Y——芦丁浓度，mg/mL；

（2）样品中总黄酮含量的测定：精密取适量黄酮提取液于25mL容量瓶中，其余步骤与标准曲线的绘制方法相同，测定吸光度值，照标准曲线法计算总黄酮的含量，按式（2）计算提取率：

式中：

Y——黄酮提取率，%；

C——被测液黄酮浓度，mg/mL；

V1——测定时吸取的黄酮提取液体积，mL；

V——黄酮提取液的总体积，mL；

M——原料粉质量，g；

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 夹带剂用量对黄酮提取率的影响 由图1可知，随着夹带剂用量的增加，黄酮提取率先增加后减少。这是因为夹带剂的加入，改善了超临界流体对黄酮的溶解性和选择性，但用量过多，反而会使超临界CO2流体的渗透力减弱。因此，只有夹带剂量适当，才能达到理想的萃取效果，可以看出，当夹带剂用量为2∶1（V∶m）时黄酮提取率最高。

图1 夹带剂用量对黄酮提取率的影响Figure 1 Effect of amount of entrainer on extraction rate of flavonoids

2.1.2 萃取压力对黄酮提取率的影响 由图2可见，随着萃取压力的提高，溶剂的溶解能力增强，黄酮提取率增大。当压力增大到一定程度时，继续增加压力，超临界流体的黏度增加，使得流体的传质速率下降，影响萃取效果，当压力＞28MPa时，提取率呈降低趋势。

2.1.3 萃取温度对黄酮提取率的影响 由图3可知，在其它条件恒定的情形下，黄酮提取率先随温度的升高而增大，44℃时达到最大值，而后开始下降，这是因为密度变化引起的溶解能力占主导所致［11］。

2.1.4 萃取时间对黄酮提取率的影响 由图4可知，随着萃取时间的延长，溶剂的传质能力逐步达到良好状态，萃取量逐渐增加，萃取率增大，至150min时达到较大值。当黄酮基本溶出，继续延长萃取时间，萃取率增幅不大。

图2 萃取压力对黄酮提取率的影响Figure 2 Effect of extracting pressure on the extraction rate of flavonoids

图3 萃取温度对黄酮提取率的影响Figure 3 Effects of extracting temperature on the extraction rate of flavonoids

图4 萃取时间对黄酮提取率的影响Figure 4 Effect of extracting time on the extraction rate of flavonoids

2.1.5 CO2流量对黄酮提取率的影响 由图5可知，随着CO2流量的增加，流体的湍流和扰动加强，增加了流体分子与溶质间的碰撞机会，萃取速率提高。但流量过大，会使超临界流体与待萃取组分接触时间减少，影响萃取效果。CO2流量对黄酮提取率的影响呈抛物线形，流量为21L/h时，黄酮提取率最高。

2.2 正交试验

根据单因素的试验结果确定用量为2∶1（V∶m），选取萃取温度、压力、时间、CO2流量四因素进行正交试验优化研究，以确定超临界流体萃取的最优化工艺，正交试验的因素及水平取值见表1，结果见表2。

图5 CO2流量对黄酮提取率的影响Figure 5 Effect of CO2flow on the extraction rate of flavonoids

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 超临界流体萃取苦瓜叶总黄酮正交试验结果与极差分析Table 2 The results and analysis of orthogonal test

由表2可知，萃取温度、压力、时间、CO2流量四因素对黄酮提取率影响的主次顺序：萃取压力＞温度＞CO2流量＞萃取时间。苦瓜叶中黄酮的超临界流体萃取最佳工艺条件是：A2B2C3D2，即萃取压力28MPa，温度44℃，CO2流量22L/h，萃取时间150min。

2.3 验证实验

按正交试验确定的最佳提取工艺条件，进行3次重复试验，黄酮提取率分别为3.70%，3.65%，3.81%，平均提取率为3.72%，与理论预测值的相对误差为1.06%，表明正交试验得出的最优工艺是符合实际的。

3 结论

（1）前期预试验发现，在相同条件下对原料进行乙醇浸润预处理以后进行超临界萃取，比直接固体进料进行超临界萃取黄酮平均提取率高28%以上。

（2）超临界流体萃取苦瓜叶中总黄酮的最佳工艺条件为：以用量为1∶1（V∶m）的95%乙醇对原料进行浸润1h（预处理），用量为2∶1（V∶m）的95%乙醇为夹带剂，控制CO2流量22L/h，压力28MPa，温度44℃，循环萃取150min。

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11 岳红，赵晓莉，张颖.超临界二氧化碳萃取柿叶黄酮的工艺研究［J］.化学研究与应用，2005，17（3）：421～423.

Study on extraction of flavones frommomordica charan tialeaves L.by supercritical CO2fluid

WANG Wen－yuan1TANG Shou－yong1LONGHong－ping2

（1.Hunan Yongzhou Vocational Technical College，Yongzhou，Hunan425000，China；2.School of Pharmacy，Central South University，Changsha，Hunan410013，China）

The extraction technology of flavonoids frommomordica charantialeaves L.by supercritical CO2fluid was studied and the processing parameters were optimized.Based on the single experiments and orthogonal tests，the optimal process conditions were as follows：soak the matrix by 95%ethanol（contrast to matrix 1∶1）for one hour，95%ethanol（contrast to matrix 2∶1）serve as entrainer.CO2flow rate 22L/h，extracting pressure 28MPa，extracting temperature 44 ℃，and extracting time 150min.The yield of flavonoids was 3.69%under the optimal condition.

SFE；momordica charantialleaves；flavonoids；extraction

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.024

湖南省教育厅重点项目（编号：09C1294）

王文渊（1969－），男，湖南永州职业技术学院副教授。E－mail：wwy07＠163.com

2011－05－01