外源性HGF基因转染对肺动脉高压兔肺血流灌注及肺动脉压力的影响*

王 伟， 张 芳， 谢 悦， 张宜乾， 吴树明

(1徐州医学院附属医院心胸外科，江苏 徐州 221002；2江苏省中医药研究院风湿免疫科，江苏 南京 210028；3山东大学齐鲁医院心脏外科，山东 济南 250012)

外源性HGF基因转染对肺动脉高压兔肺血流灌注及肺动脉压力的影响*

王 伟1△▲， 张 芳2▲， 谢 悦1， 张宜乾1， 吴树明3

(1徐州医学院附属医院心胸外科，江苏 徐州 221002；2江苏省中医药研究院风湿免疫科，江苏 南京 210028；3山东大学齐鲁医院心脏外科，山东 济南 250012)

目的探讨外源性肝细胞生长因子(HGF)基因转染高动力性肺动脉高压家兔后促进侧支肺血管生成、改善肺血流灌注、降低肺动脉压力的可行性。方法将肺动脉高压兔随机分为对照组、空病毒组和HGF基因转染组；HGF基因转染组经气管内滴入法转染Ad-HGF，对照组和空病毒组分别气管内滴入同体积PBS液和Adeno-Null；4周后，通过MacLab/8s多功能生理仪行血流动力学检测，通过抗FⅧ+α-SMA抗体免疫荧光双标检测肺小动脉密度、FITC-lectin灌注+抗α-SMA荧光双标记了解肺血管灌注情况。结果气管内给药4周后，HGF基因治疗组含平滑肌细胞的小动脉密度较肺动脉高压对照组和空病毒组(12.5±2.7)/mm2明显增多(Plt;0.05)；HGF组肺血流灌注获得有效改善，而肺动脉高压对照组和空病毒转染组肺血管仍处于狭窄甚至闭塞状态；HGF治疗组肺动脉平均压明显低于肺动脉高压对照组和空病毒转染组(Plt;0.05)。结论肺动脉高压模型动物经气管滴入法转染外源性HGF，可以促进肺侧支血管生成，增加肺灌注并有效降低肺动脉压力。

肝细胞生长因子； 血管新生； 基因治疗； 肺动脉高压

高动力性肺动脉高压是左向右分流型先心病常见并发症[1]。目前认为，在其形成的早期，及时手术矫治心内畸形，可阻止肺动脉高压的进一步发展[2]。由于医疗条件所限，现阶段我国存在大批高动力性肺动脉高压病人。肺动脉在长期高血流的冲击下，出现肌层增厚、纤维化、血管床逐步减少，病变进入到不可逆阶段，传统的扩血管治疗将失去意义。目前，国内外很多学者都把目光投向改善血管重构、促进血管再生的研究上，这是当前肺动脉高压研究的热点、难点，也是纠治其病理演变的希望所在。

肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)作为一种高效的促血管生成因子，目前已被广泛应用于缺血性疾病的治疗上[3,4]。本研究在家兔高动力性肺动脉高压模型上，经气管途径转染人HGF基因(h-HGFcDNA)，观察在肺动脉高压形成的特定病理改变下，外源性基因促进侧支血管建立、改善肺组织血流灌注并降低肺动脉压力的作用，为高动力性肺动脉高压的治疗提供新思路。

材 料 和 方 法

1材料

1.1基因 携带HGF基因的重组腺病毒(Ad-HGF)和不携带HGF基因的空病毒(Adeno-Null)由军事医学科学院合成，吴祖泽院士惠赠。该病毒是复制缺陷的人血清5型腺病毒，含CMV启动子，Ad-HGF病毒感染滴度为9×1013pfu/L，Adeno-Null病毒感染滴度为1.1×1014pfu/L。

1.2肺动脉高压动物模型 1月龄幼兔，雌雄不拘，体重(540±24) g，由徐州医学院实验动物中心提供。麻醉下前胸正中开胸，行左颈总动脉与肺动脉主干吻合，形成体-肺动脉分流，3月后建立高动力性肺动脉高压模型[5]。

1.3主要试剂及仪器

① 主要试剂 HE染色试剂盒(北京中杉金桥公司)、FITC-lectin(Sigma)、小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白抗体(mouse anti-rat α-SMA antibody,武汉博士德生物工程有限公司)、罗丹明标记山羊抗鼠荧光Ⅱ抗(rhodamine-labeled goat anti-mouse fluorescent secondary antibody,北京中杉金桥公司)、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)标记山羊抗小鼠荧光Ⅱ抗(FITC-labeled goat anti-mouse fluorescent secondary antibody,北京中杉金桥公司)和鼠抗人HGF单克隆抗体 (mouse anti-human HGF monoclonal antibody，Aamp;D)。

② 主要仪器 MacLab hemodynamic recording system(Instruments)，Micron石蜡切片机(Leica)，CK40倒置显微镜(Olympus)，PM-CB20显微照相系统(Olympus)。

2方法

2.1实验分组及剂量设置 在进行药效研究时，高动力性肺动脉高压家兔随机分成3组，每组12只。具体处理如下：

(1)对照组(C组)：气管内滴入PBS液0.2 mL；(2)空病毒对照组(N组):气管内滴入Adeno-Null 2×109pfu/只；(3)HGF治疗组(H组):气管内滴入Ad-HGF2×109pfu/只。

2.2血流动力学变化检测 给药1月后，经动物耳缘静脉推注硫喷妥钠麻醉。原切口开胸，于升主动脉及肺动脉主干分别用7-0无损伤单丝线缝荷包，插入4F测压管，通过Mac-Lab/8s多功能生理仪同步监测血流动力学指标，包括：肺动脉收缩压(pulmonary artery systolic pressure,PASP)、肺动脉舒张压(pulmonary artery diastolic pressure,PADP)、肺动脉平均压(mean pulmonary artery pressure,mPAP)及主动脉平均压(mean systemic arterial pressure,mSAP)。

2.3抗FⅧ+α-SMA抗体免疫荧光双标检测肺血管形态 石蜡切片，常规脱蜡复水，于枸橼酸钠中抗原热修复(95 ℃ 2 min)。3% H2O2室温浸泡10 min。室温下，0.01 mol/L PBS 缓冲液( pH 7.4)冲洗切片，5 min×3；5%BSA封闭(37 ℃ 1 h)，倾去勿洗；将α-平滑肌肌动蛋白Ⅰ抗(鼠抗兔，1∶100)和Ⅷ因子相关抗原Ⅰ抗(兔抗人)按1∶1的比例混匀，滴加在切片上4 ℃过夜。(以下所有步骤注意避光)将罗丹明标记山羊抗小鼠荧光Ⅱ抗(1∶200)和FITC标记山羊抗小鼠荧光Ⅱ抗按1∶1的比例混匀滴加在切片上，37 ℃孵育1 h。室温下，0. 01 mol/L PBS 缓冲液( pH 7.4)冲洗切片，荧光显微镜观察并拍照。200倍镜下每张切片随机选取3-4个视野拍照，以Image-Pro plus 6.0软件对免疫组化照片进行绿色(FⅧ)和红色(α-SMA)荧光阳性区域计数。

2.4肺血管灌注检测 FITC-lectin灌注： 各组动物行肺动脉测压后，剪开左心房，自测压管注入0.1%PBS冲洗肺血干净后，取左肺(尽量不要损伤肺，注意保留肺门结构)，以测压管经左肺动脉注入FITC-lectin溶液，待lectin自左肺静脉流出时结扎左肺动静脉。取肺组织边缘区组织，4%多聚甲醛浸泡固定(4 ℃)。6 h后浸泡30%蔗糖过夜。待浸泡蔗糖沉底后冰冻切片(40 μm)，室温下，0.01 mol/L PBS 缓冲液(pH 7.4)漂洗后加入α-平滑肌肌动蛋白Ⅰ抗(兔抗大鼠，1∶100)4 ℃过夜；漂洗后加入罗丹明标记山羊抗兔荧光Ⅱ抗(1∶200)室温孵育1 h；荧光显微镜观察并拍照。

2.5血气分析及右心室肥厚指标检测 各组动物给药后4周，开胸时抽取动脉血，行血气分析。动物处死后切取心脏， 沿右心室与室间隔相连处剪开心脏，分离出右心室(right ventricle,RV)和左心室+室间隔(left ventricular and septum,LV+S)，用滤纸吸干水分后用电子天平分别称重(WRV和WLV+S),计算WRV/WLV+S的值[6]。

3统计学处理

结 果

1血流动力学变化

1月后，HGF治疗组肺动脉平均压[(15.4 ± 3.4)mmHg]明显低于对照组[(21.1 ± 2.6) mmHg]和空病毒转染组[(22.0±2.8)mmHg]，见表1。

2抗FⅧ因子与抗α-SMA免疫荧光双标检测新生血管密度及形态

以抗FⅧ因子与抗α-SMA荧光双标检测新生血管密度与形态，血管内皮细胞通过抗FⅧ因子以FITC标记，呈绿色荧光；平滑肌细胞通过抗α-SMA以罗丹明标记，呈红色荧光,见图1。

对照组：红色荧光标记的血管平滑肌细胞数目[(10.5±3.2)/mm2]较少，部分呈实性光斑，表明有动脉管腔闭塞现象，标记内皮细胞的绿色荧光暗淡，呈散在点样分布。空病毒组：与对照组比较，血管平滑肌细胞数[(12.5±2.7)/mm2]无明显增加，同样存在管腔闭塞现象，绿色荧光标记的内皮细胞分布和数量无明显变化。HGF组:血管平滑肌细胞数目[(18.5±3.1)/mm2]明显增多，且管腔结构完整。内皮细胞的绿色荧光较强，呈片状分布。与前两组比较，差异显著。

表1 治疗后各组血流动力学变化

3FITC-lectin灌注与抗α-SMA免疫荧光标记检测血管功能与结构

Lectin带有FITC标记(呈绿色荧光)，经肺动脉灌注可以标记具有管腔且有血流通过的血管，肺动脉及支气管的平滑肌细胞通过抗α-SMA以罗丹明标记，呈红色荧光。结果表明：对照组和空病毒组肺组织内肌型肺小动脉稀少，管腔狭窄，血流灌注差。HGF组血流灌注丰富，肌型肺小动脉明显增多，与对照组和空病毒组比较差异显著，见图2。

4血氧分压及右心室厚度的变化

HGF组动脉血氧分压升高，与对照组和空病毒组比较，差异显著。HGF组右心室厚度(WRV/WLV+S)与对照组、空病毒组比较未见显著差异，见表2。

Figure 2. Double-labeling immunofluorescence of FITC-lectin pulmonary perfusion and anti α-SMA(×200).A: contral group;B：Ad-Null group;C:Ad-HGF group. Lectin labeled with FITC in the lung vessels showed green fluorescence.Smooth muscle cells with rhodamine labeled α-SMA antibody showed red fluorescence.

表2 各组间动脉血氧分压及右心室厚度的比较

讨 论

高动力性肺动脉高压形成的确切机制尚不清楚。目前认为，肺血管受到高血流冲击时，由于机械应力的刺激，出现血管内皮细胞损伤，导致肺小动脉平滑肌过度增殖，从而造成管腔狭窄甚至闭锁及进行性肺血管床减少，最终导致肺动脉高压的形成。由于中、晚期肺动脉高压患者肺血管中层的增厚和平滑肌纤维化，传统的扩血管治疗效果不理想。近年来，血管新生治疗已成为多个研究领域内的热点，尤其对于器官的缺血性病变，通过体外转染血管生成基因诱导新生血管形成(治疗性血管新生)改善组织或器官的灌注，减少血流阻力而达到治疗目的[7,8]。

我们在前期研究中发现，携带外源性基因的腺病毒经支气管内滴入，2周后目的基因可出现在支气管上皮、肺泡上皮细胞及血管内皮细胞，并通过旁分泌的方式在局部形成作用。该方法具有转染效率高、毒副作用小的优点[9]。

肺动脉高压所致肺血管重构中，肺腺泡内动脉是调控肺血流动力学的关键血管，它在形态学上包括肌型、部分肌型和非肌型3种不同结构的血管段。其中部分肌型、非肌型肺动脉肌型化，管壁增厚，管腔狭窄是肺高压形成的病理基础[10]。本研究发现，Ad-HGF转染后4周，肺组织病理观察可见肌性和部分肌性肺小动脉较对照组明显增多，且管腔结构完整，内皮细胞分别均匀，为肺动脉侧支血管建立提供直接证据。

本研究中，我们采用FITC-lectin与抗α-SMA免疫荧光双标记法检测新生血管是否具备血流灌注功能。Lectin能特异地与血管内皮细胞细胞膜上的N-乙酰-β- D -氨基葡萄糖寡聚体共轭结合，且本身带有FITC绿色荧光标记，经肺动脉灌注可以精确标记具有管腔且有血流通过的血管，而肺血管及支气管平滑肌细胞则通过抗α-SMA以罗丹明标记，呈红色荧光。研究表明，外源性HGF基因转染后4周，肺组织内功能肺血管明显增多，肺灌注得到有效改善，结合血气分析结果，肺氧和能力亦得以提升。

在相同的干预条件下，肺动脉压力检测显示，HGF基因治疗组肺动脉压力明显低于对照组和空病毒组，推测治疗组肺动脉压力下降与新的侧支循环建立、增加了肺血管床截面积有关。同时，不排除肺灌注改善后，氧和能力提高对肺动脉痉挛的缓解作用。其确切机制及作用时效仍有待进一步实验证实。

目前，肺动脉高压的基因治疗尚处于实验阶段，随着分子生物学和基因转移技术的发展，基因治疗即将取得突破性进展，并有望为肺动脉高压这一难治之症提供新的治疗途径。

[1] Duffels M, van Loon L, Berger R,et al.Pulmonary arterial hypertension associated with a congenital heart defect: advanced medium-term medical treatment stabilizes clinical condition[J]. Congenit Heart Dis,2007,2(4):242-249.

[2] Roos-hesselink JW,Meijboom FJ,Spitaels SE,et al. Outcome of patients after surgical closure of ventricular septal defect at young age: longitudinal follow-up of 22-34 years[J].Eur Heart J, 2004 ,25(12):1057-1062.

[3] Azuma J, Taniyama Y, Takeya Y, et al. Angiogenic and antifibrotic actions of hepatocyte growth factor improve cardiac dysfunction in porcine ischemic cardiomyopathy[J]. Gene Ther, 2006,13(16):1206-1213.

[4] Funatsu T, Sawa Y, Ohtake S, et al. Therapeutic angiogenesis induced by myocardial injection of naked cDNA plasmid encoding hepatocyte growth factor in ischemic canine heart[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2002,124(6):1099-1105.

[5] 王 伟,张宜乾,吴树明.兔高动力性肺动脉高压模型的建立[J]. 中国病理生理杂志,2006,22(3):612-613,617.

[6] Nagumo K,Yamaki S,Takahashi T.Extremely thickened media of small pulmonary arteries in fatal pulmonary hypertension with congenital heart disease:a morphometric and clinicopathological study[J].Jpn Circ J, 2000, 64(12):909-914.

[7] Morishita R, Aoki M, Hashiya N, et al.Safety evaluation of clinical gene therapy using hepatocyte growth factor to treat peripheral arterial disease[J]. Hypertension, 2004,44(2):203-209.

[8] Taniyama Y, Morishita R, Hiraoka K, et al. Therapeutic angiogenesis induced by human hepatocyte growth factor gene in rat diabetic hind limb ischemia model: molecular mechanisms of delayed angiogenesis in diabetes[J]. Circulation,2001,104(19): 2344-2350.

[9] 王 伟, 吴树明,张中明,等. 经气管/静脉途径行肺脏腺病毒载体基因转染的效率和毒性分析[J]. 中国病理生理杂志,2008,24(12):2493-2496.

[10]Yuan JX, Rubin LJ. Pathogenesis of pulmonary arterial hypertension: the need for multiple hits[J]. Circulation, 2005,111(5): 534-538.

EffectofexogenousHGFgenetransfectiononpulmonaryperfusionandpressureinpulmonaryarteryhypertensioninrabbits

WANG Wei1, ZHANG Fang2, XIE Yue1, ZHANG Yi-qian1, WU Shu-ming3

(1DepartmentofCardiothoracicSurgery,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221002,China;2DepartmentofRheumatology,JiangsuProvinceAcademyofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210028,China;3DepartmentofCardiovascularSurgery,QiluHospital,ShandongUniversity,Jinan250012,China.E-mail:wangwei-doctor@163.com)

AIM: To investigate the feasibility of exogenous hepatocyte growth factor (HGF) gene transfection to promote pulmonary collateral angiogenesis, improve pulmonary perfusion and reduce pulmonary artery pressure in the rabbit model of pulmonary artery hypertension (PAH).METHODSThe model rabbits of PAH were randomly divided into control group, empty vector group andHGFgene transfection group. The rabbits inHGFgene transfection group were transfected with Ad-HGFvia intratracheal instillation. Pulmonary hemodynamic indicators were monitored in the 4th week afterHGFgene transfection. Density of pulmonary vessels was examined with double-labeling immunofluorescence (endothelial cells were labeled with anti-FⅧ and vascular smooth muscle cells were marked with anti-α-SMA). Double-labeling immunofluorescence of FITC-lectin and anti-α-SMA was also performed to evaluate the pulmonary blood perfusion.RESULTSFour weeks after transfection, the density of pulmonary arterioles of the rabbits inHGFgene transfection group was higher than that in control group and empty vector group (Plt;0.05), which was confirmed by double-labeling immunofluorescence. Pulmonary blood perfusion inHGFgroup was significantly increased compared with that in the other two groups, in which pulmonary arterial stenosis and occlusion were observed. The mean pulmonary artery pressure inHGFtransfection group was much lower than that in control group and empty vector group (Plt;0.05).CONCLUSIONFour weeks after intratracheal adenoviral-mediatedHGFgene transfection, pulmonary collateral vessels and pulmonary perfusion increase, and the pulmonary artery pressure is effectively reduced.

Hepatocyte growth factors; Angiogenesis; Gene therapy; Pulmonary artery hypertension

1000-4718(2011)11-2217-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.035

2011-05-25

2011-09-22

国家自然科学基金资助项目(No.30571845)；江苏省自然科学基金资助项目(No.BK2007033)；江苏省高校自然科学基金资助项目(No.07KJD310218)；徐州市科技计划项目(No.XM09B072)

△通讯作者 Tel：0516-85802040;E-mail:wangwei-doctor@163.com

▲并列第1作者