缩醛基毛冬青提取化合物R4对缺氧/复氧大鼠心肌细胞的保护作用*

付晓春， 徐 哲， 陈建军

(广东食品药品职业学院，广州 广东 510600)

缩醛基毛冬青提取化合物R4对缺氧/复氧大鼠心肌细胞的保护作用*

付晓春△， 徐 哲， 陈建军

(广东食品药品职业学院，广州 广东 510600)

目的探讨缩醛基毛冬青提取化合物R4对缺氧/复氧损伤心肌细胞的保护作用及其机制。方法采用原代培养的新生大鼠心肌细胞建立缺氧/复氧损伤模型，实验分为正常细胞培养组和缺氧/复氧损伤模型组、缺氧/复氧损伤+缩醛基毛冬青提取化合物R4(5、10、20 μmol/L)组和缺氧/复氧损伤+ verapamil(5 μmol/L)组。用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性，硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛(MDA)含量，MTT染色法测定线粒体脱氢酶活性改变，化学比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)活性变化, Griess法测定一氧化氮(NO)的含量。结果缩醛基毛冬青提取化合物R4可显著提高缺氧/复氧损伤心肌细胞内SOD的活性及细胞内线粒体脱氢酶活性，能显著抑制LDH的活性、MDA的生成以及提高NO的含量,并能明显抑制心肌细胞凋亡。结论缩醛基毛冬青提取化合物R4具有明显抗缺氧/复氧损伤、保护心肌细胞的作用。

缩醛基毛冬青提取化合物R4； 心肌细胞； 超氧化物歧化酶； 丙二醛； 乳酸脱氢酶； 缺氧/复氧

毛冬青为冬青科植物冬青属毛冬青(IlexpubescensHook.et Arn)的干燥根，冬青属是冬青科3个属中我国仅有的1个属。毛冬青是我国南方常用的中药材，是岭南地区的特色中药材，具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒的功效。目前毛冬青的抗心肌缺血作用主要集中在毛冬青甲素等三萜类化合物的生物活性研究上。我们通过对含有缩醛侧链的酚酸类成分的深入研究，发现缩醛基毛冬青提取化合物(acetal hairy holly extractive compound R4,AHHECR4)具有较强的抗心肌缺血的药理活性。本文拟从细胞水平进行AHHECR4对缺氧/复氧损伤心肌细胞的保护作用及其机制研究，为开发新型抗心肌缺血药物提供坚实的理论基础。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要试剂 DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum) 购自北京华美试剂公司，噻唑蓝[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5 - diphenylterazolium bromide, MTT]为Sigma产品，AHHECR4(结构式见图1)为沈阳药科大学化学合成教研室提供。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

Figure 1. Structure of AHHECR4.

1.2动物 出生后2-3 d大鼠，由广州市白云区穗北实验动物养殖场提供。

1.3仪器 CO2培养箱(NuAir),倒置显微镜(LEICA DM IRB)(Leica),CJT808超净化工作台(沈阳市医疗器械二厂),80-1台式离心沉淀机(上海手术器械厂),酶标仪(Bio-Rad)，650-60荧光分光光度计(HITACHI), FACSAria 流式细胞仪(BD Biosciences)。

2方法

2.1乳鼠心肌细胞培养 2-3日龄的Wistar乳鼠，用75%乙醇浸泡消毒，剪开胸腔取心尖部组织，剪成1 mm×1 mm×1 mm碎块放入大离心管中，用0.25%胰蛋白酶溶液8 mL，在恒温振荡器37 ℃水浴中消化10 min，用吸管吹打组织块1 min，自然沉淀后，将上清液及沉淀物分别处理。上清液移至另一无菌离心管中，加入2 mL冷培养基以终止消化，离心10 min，弃上清液。沉淀中加入D-Hanks液6 mL，混悬后离心，充分洗去胰蛋白酶[1-3]。最后用20%胎牛血清的DMEM培养基，将心肌细胞制成细胞悬液备用。沉淀组织块再加胰蛋白酶消化沉降，其上清重复上述步骤。沉淀组织反复消化，直至完全消化为止。上述消化制备的心肌细胞经差速贴壁纯化后制成5×108/L的细胞悬液(细胞纯度达95%以上)，分装于25 mL培养瓶内，在5%CO2、37 ℃培养箱中培养。

2.2实验分组 参照文献[4-6],取培养4 d的心肌细胞若干瓶，分为正常细胞培养组、缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)损伤模型组、H/R+AHHECR4小剂量(5 μmol/L)组、H/R+AHHECR4中剂量(10 μmol/L)组、H/R+AHHECR4大剂量(20 μmol/L)组和H/R+ 阳性对照药verapamil(5 μmol/L)组。AHHECR4在缺氧及复氧期均给药。

2.3缺氧/复氧模型建立 用不含胎牛血清的DMEM培养基充入氮气(纯度99.99%)，饱和15 min，置换培养瓶中的正常培养基后，再向瓶内充氮30 s，然后旋紧瓶盖37 ℃培养2 h后，换正常培养基充入95%O2、5% CO2复氧后培养1 h。

2.4观察指标及检测方法

① 心肌细胞SOD活性及MDA含量测定 缺氧2 h再给氧1 h，用黄嘌呤氧化酶法测定SOD的活力，硫代巴比妥酸显色法测定MDA含量。

② 细胞内线粒体脱氢酶活性测定LDH 缺氧2 h再给氧1 h后，MTT染色法测定细胞吸光度(A)值。具体方法如下:细胞用胰酶消化制成细胞悬液加入96孔板中,每孔加100 μL，培养24 h后，用D-Hanks液冲洗2次，分别以含20 %胎牛血清的DMEM(正常组)及充氮饱和的无血清DMEM加入培养板(模型组)，此模型组造成缺氧需在密避容器中进行，向密闭容器中充入高纯氮气20 min，2 h后将培养板放入正常条件下培养1 h后，每孔加入5%MTT 20 μL培养4 h后吸去上清，每孔加入DMSO 100μL，振荡3 min后在酶标仪上570 nm测A值。用药组在缺氧前及复氧后均应给药。

③ 培养基质LDH活性测定 缺氧2 h再复氧1 h后，按照LDH试剂盒说明测定其含量[7,8]。

④ 一氧化氮(nitric oxide,NO)的测定 NO化学性质活泼，在体内很快转化为硝酸盐(NO3-)和亚硝酸盐(NO2-)，而NO2-又进一步转化为NO3-。本法利用Griess试剂将NO3-还原为NO2-，通过显色的深浅测定浓度。在96孔板中，加入100 μL/well培养介质与等量的Griess试剂，室温放置10 min，在酶联免疫检测仪550 nm处测A值[9]。根据亚硝酸钠标准曲线计算样本中的NO2-含量。Griess试剂的配制参照文献方法[10]。NO的标准曲线的制备：用双蒸水配制7种不同浓度的亚硝酸钠溶液25、50、75、100、125、150、175 μmol/L，按上述方法测A值，以亚硝酸钠浓度为横坐标，A值为纵坐标，绘制标准曲线。

Y=215.91X-12.182，R2=0.9994

⑤ 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率 缺氧2 h再复氧1 h后, 以PBS清洗, 加入1 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶 (propidium iodide，PI) 至细胞悬液中, 轻轻摇匀,置冰浴中反应10 min, 加入400 μL预冷的binding buffer至样品中, 1 h内上机检测[11]。

3统计学处理

结 果

1心肌细胞SOD活性及MDA含量测定

模型组与正常组相比SOD活性显著降低，MDA含量显著升高，AHHECR4各剂量组及阳性对照药verapamil组均可显著提高H/R心肌细胞SOD活性,降低MDA的含量,与空白对照组相比，差异显著(Plt;0.05或Plt;0.01)，见表1。

表1 AHHECR4对缺氧/复氧损伤心肌细胞的SOD活性及MDA含量的影响

2细胞内线粒体脱氢酶活性测定

H/R组细胞A值较对照组下降(Plt;0.01),而AHHECR4各剂量组( 5、10、20 μmol/L组)及verapamil组A值均较H/R组升高 (Plt;0.01)。A值的大小可以反映细胞内线粒体脱氢酶的活性，提示AHHECR4可提高线粒体脱氢酶的活性，见表2。

表2 AHHECR4对缺氧/复氧损伤心肌细胞内A值及培养基质LDH活性和NO含量的影响

3培养基质LDH活性测定

与正常组相比，模型组LDH水平显著升高(Plt; 0.01)，各剂量组AHHECR4及verapamil组均能显著减少模型组培养介质中LDH水平，尤以20 μmol/L最为明显,见表2。

4NO含量的测定

H/R造成心肌细胞代谢率降低，NO水平显著降低，各剂量组AHHECR4及verapamil能显著提高心肌细胞的代谢率，升高模型组培养介质中NO水平，见表2。

5流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率

与正常组相比,模型组心肌细胞凋亡率明显增加,正常细胞明显减少(Plt;0.01)；与模型组相比, 给予AHHECR4( 5、10、20 μmol/L)及verapamil预处理后,心肌细胞凋亡率明显减少(Plt;0.05, 或Plt; 0.01),表明AHHECR4及verapamil可明显抑制心肌细胞的凋亡, 且在一定范围内随AHHECR4剂量的增大，表现出量效关系,见表3。

表3 AHHECR4对缺氧/复氧损伤心肌细胞凋亡率的影响

讨 论

心肌细胞缺氧时能量代谢障碍、心肌细胞膜受损。再灌注时, 随着大量氧的涌入, 产生大量氧自由基, 造成细胞膜脂质过氧化, 生物膜损伤, MDA 是氧自由基攻击生物膜不饱和脂肪酸的终产物, 其值高低间接反映机体细胞受自由基损伤程度; SOD 是一种存在于细胞液中的抗氧化酶, 它可清除超氧阴离子, 保护机体免受超氧阴离子损伤, 其值高低间接反映机体清除氧自由基的能力[10,11]。MDA是脂质过氧化反应的产物之一，其高低常常可反映脂质过氧化的程度。

研究表明，H/R组与正常对照组相比SOD活性明显降低，MDA水平显著升高，说明脂质过氧化剧烈，细胞受到严重损伤，而在AHHECR4各给药组，SOD活性均较H/R组明显增高，MDA水平低于H/R组，提示AHHECR4可降低心肌细胞脂质过氧化反应，提高心肌细胞清除氧自由基的能力。

体外培养的乳鼠心肌细胞可因许多因素造成损伤，受损时生长、代谢等将受到影响，其中LDH的外漏可作为判断损伤的重要依据。LDH释放量的多少可反映细胞膜损伤程度。结果表明AHHECR4可显著抑制LDH的活性，对心肌细胞膜具有保护作用。

MTT是一种可以进入活细胞的染料。A值反映出心肌细胞内线粒体脱氢酶的活性，同时还间接反映心肌细胞的存活情况。AHHECR4可以明显提高H/R损伤中心肌细胞线粒体脱氢酶的活性，具有抗H/R线粒体损伤的作用。

近年来研究表明NO在神经、免疫、心血管等系统具有广泛而复杂生理与病理作用。NO是一种新型的生物信息递质，具有抗血小板聚集，抑制血管平滑肌细胞增生等作用，NO生成量减低可能加速心肌缺血的发生发作。AHHECR4能使NO生成回升且呈剂量依赖性，从而具有抗心肌缺血的作用。

心肌细胞的凋亡是缺血性心肌细胞损伤病变的重要形式之一, 在心肌细胞凋亡的发生过程中, 缺血是细胞凋亡的诱导者, 再灌注具有加速心肌细胞凋亡的作用, 而其中氧自由基的形成是再灌注期间组织损伤的病理机制之一[12]。心肌细胞H/R损伤的另一个重要表现是心肌细胞的凋亡。在本实验中我们用流式细胞仪双标法染色, 测定细胞凋亡率, 结果发现AHHECR4可明显抑制心肌细胞凋亡, 对H/R 损伤心肌细胞凋亡有明显保护作用。

结果表明，AHHECR4对H/R心肌细胞损伤具有一定的保护作用，其作用与verapamil的作用相当，其作用机制可能是通过提高H/R心肌细胞内SOD的活性，抑制MDA的生成及培养介质中LDH的活性, 提高细胞LDH的活性，并使NO生成回升有关。

综上所述，AHHECR4具有明显的抗H/R损伤，保护心肌细胞的作用。本研究为开发新型抗心肌缺血药物提供了坚实的理论基础。

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EffectsofacetalhairyhollyextractivecompoundR4onratcardiomyocyteinjuryinducedbyhypoxia/reoxygenation

FU Xiao-chun, XU Zhe, CHEN Jian-jun

(GuangdongFoodandDrugVocationalCollege,Guangzhou510600,China.E-mail:fxc1968@163.com)

AIM: To observe the effects of acetal hairy holly extractive compound R4(AHHECR4) on myocardial cell injury induced by hypoxia/reoxygenation.METHODSThe model of rat myocardial cell injury was induced by hypoxia/reoxygenation. The activity of superoxide dismutase (SOD) in the myocardial cells was measured by the method of xanthine oxidase. The content of malondialdehyde (MDA) was determined by the method of thiobarbituric acid. The activity of dehydrogenase (A) in mitochondria was detected by MTT assay. The activity of lactate dehydrogenase(LDH) and the content of NO in the culture medium were also evaluated.RESULTSAHHECR4 at concentrations of 5, 10 and 20 μmol/L remarkably increased SOD activity and the value ofA, and significantly inhibited MDA production and LDH leakage. Greatly increased content of NO in the culture medium was also observed.CONCLUSIONThe results indicate that AHHECR4 has a protective effect on myocardial cells under the condition of hypoxia/reoxygenation injury.

Acetal hairy holly extraction compound R4; Cardiomyocytes; Superoxide dismutase; Malondialdehyde; Lactate dehydrogenase; Hypoxia/reoxygenation

1000-4718(2011)11-2082-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.007

2011-04-14

2011-09-15

广东省自然科学基金资助项目(No.10151052005000014)

△通讯作者 Tel：020-28854983；E-mail: fxc1968@163. com