Intermedin1-53对大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响*

薛立华， 梁 颖， 宋君秋， 齐永芬， 贾月霞△

(1宁夏医科大学基础医学院病理生理学系，宁夏 银川 750004；2北京大学医学部生理与病理生理学系，北京 100083)

Intermedin1-53对大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响*

薛立华1， 梁 颖1， 宋君秋2， 齐永芬2， 贾月霞1△

(1宁夏医科大学基础医学院病理生理学系，宁夏 银川 750004；2北京大学医学部生理与病理生理学系，北京 100083)

目的研究intermedin1-53(IMD1-53)对醛固酮(ALD)促SD乳鼠心肌成纤维细胞(CFBs)增殖的影响及细胞外信号调节激酶(ERK)信号转导途径的作用。方法分离培养SD乳鼠CFBs，将细胞分成对照组、不同浓度ALD组、ALD+不同浓度IMD1-53组，用MTT比色法测定细胞活性。通过Western blotting方法观察IMD1-53对ALD诱导的p-ERK蛋白表达的影响。结果(1) IMD1-53对基础状态下的CFBs增殖无明显抑制作用，但能呈浓度(10-9～10-7mol/L)依赖性地抑制ALD刺激CFBs的增殖。(2) IMD1-53具有浓度(10-9～10-7mol/L)依赖性地抑制ALD诱导的p-ERK蛋白表达的作用。结论IMD1-53通过ERK信号途径抑制ALD促CFBs增殖的效应。

Intermedin1-53； 心肌成纤维细胞； 醛固酮; ERK通路

流行病学研究显示，心肌纤维化是心室重构的主要病理特征之一，纤维化的改善使肥厚或不肥厚的心室组织的僵硬度减轻，并且心血管事件相关危险性减少。因此，寻找有效抑制并逆转心肌纤维化的措施具有重要临床价值。Intermedin1-53(IMD1-53)是Roh等[1]用系统进化分析法以降钙素基因相关肽(calcium gene-related peptide, CGRP)超家族成员特异的一二级结构检索基因库得到了该家族的一个新成员IMD，IMD的组织分布十分广泛，下颌下腺、肾脏、胃肠道、肺脏、心脏、脾脏、胸腺、卵巢等组织中均有IMD表达[2]，提示IMD可能广泛参与机体内环境稳态的调控。已有的研究表明，IMD可强力而持久地舒张血管、降低血压，并可改善心功能，增加冠脉流量[3, 4]，是强效的心血管活性调节肽。但IMD1-53在心肌重塑、心肌纤维化过程中起何作用及其机制尚未完全清楚。本实验通过检测IMD1-53对心肌成纤维细胞(cardial myofibroblasts,CFBs)增殖的影响，并探讨其可能的作用机制，为心肌纤维化的防治提供新的实验室数据。

材 料 和 方 法

1材料

1.1动物 选用出生1-4 d的雄性SD乳鼠，由北京大学医学部实验动物中心提供。

1.2主要试剂 合成的大鼠IMD1-53由美国Phoenix Pharmaceutical Inc.提供；DMEM培养基为Gibco产品，胰蛋白酶、MTT、醛固酮(aldosterone,ALD)、DMSO均为Sigma产品。胎牛血清购于Sigma。余为市售分析纯产品。

1.3主要仪器 超净工作台(TDGC2J-I/0.5型，苏州净化设备有限公司)，酶联免疫检测仪(BioTek Instruments Inc.)，脱色摇床(DY-132江苏兴化市分析仪器厂)，Olympus CHC-212型光学显微镜，302型二氧化碳孵育箱(Shellab)，RC5C高速低温冷冻离心机(Sorvall)，25 cm2培养瓶，96孔培养板，24孔板等。

2方法

2.1心脏成纤维细胞的培养和鉴定 取1-3 d龄的SD大鼠心脏，剪去包膜，剪成0.5～1.0 mm3小块，用0.1%胰蛋白酶消化。在5% CO2、37 ℃培养箱中培养60 min，用差速贴壁法获得心脏成纤维细胞[7]。对心脏成纤维细胞进行形态学和SABC法免疫细胞化学染色鉴定，纯度达98%，选用2～4代的心脏成纤维细胞用于实验。

2.2ALD对CFBs活性的MTT实验 取对数生长期CFBs稀释成5×104cells/well，均匀接种于96孔培养板上，每孔200 μL，37 ℃﹑5%CO2及饱和湿度条件下培养，24 h后换成含1%血清DMEM培养基。37 ℃继续孵育24 h，吸弃原培养液，设空白对照组，10%胎牛血清组和3个不同浓度ALD(10-8～10-6mol/L)的实验组继续培养24 h，各组于药物刺激结束前4 h，吸弃上清，加入MTT 20 μL，37 ℃继续培养4 h后终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，在振荡摇床上振荡10 min使结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪上570 nm处测定吸光度值(A570)。

2.3IMD1-53对ALD诱导CFBs胶原蛋白合成的影响 实验共分6组，每组重复3孔，取平均数。(1)空白对照组：不加药物； (2)10%血清组：不加药物； (3)ALD组：加入10-6mol/L ALD； (4)～(6)在3个不同浓度IMD1-53(10-9mol/L～10-7mol/L)组中分别加入10-6mol/L ALD。严格按照试剂盒操作说明书测定上清液中羟脯氨酸在550 nm处的吸光度值(A值)，并根据公式计算羟脯氨酸含量，最后通过测羟脯氨酸含量得出胶原蛋白浓度。

2.4ALD对CFBs p-ERK蛋白表达的影响 实验共分2组，每组重复3次，取平均数，实验重复3次。(1)含1%胎牛血清细胞对照组：含有DMEM的培养液； (2)ALD组：培养液中加入10-6mol/L ALD，分别在不同时点(5 min、10 min、30 min)吸弃上清，从培养板上刮取细胞，放入1.5 mL试管中，考马斯亮蓝法进行蛋白定量，行SDS-PAGE电泳，每孔上样量100 μg蛋白。转移至硝酸纤维膜(NC模)后，用含5%脱脂奶粉的TBS[20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、0.05% Tween 20、0.6%NaCl]室温下封闭1 h；羊抗大鼠p-ERK单克隆抗体、兔抗大鼠ERK单克隆抗体4 ℃孵育4 h；TBS洗脱3次后，分别加Ⅱ抗(辣根过氧化物酶标记的鼠抗羊多克隆抗体、鼠抗兔多克隆抗体)室温孵育1 h。TBS洗脱3次。利用化学发光法进行显色反应。结果用专业软件NIH ImageJ分析灰度值定量。

2.5检测IMD1-53对ALD诱导CFBs p-ERK蛋白表达的影响 实验共分4组，每组重复3孔，取平均数。(1)细胞对照组：含有DMEM的培养液； (2)IMD1-53组：培养液中加入10-7mol/L IMD1-53； (3)ALD组：培养液中加入10-6mol/L ALD； (4)(10-7mol/L)IMD1-53+(10-6mol/L) ALD组：培养液中分别同时加入10-7mol/L IMD1-53和10-6mol/L ALD，首先加入IMD1-53孵育10 min，再加入ALD共同孵育10 min，刮取细胞放入Appendorf管中，进行蛋白定量，Western blotting方法检测CFBs p-ERK蛋白的表达。

3统计学处理

结 果

1ALD对CFBs活性的影响

与含1%胎牛血清组比较，10%胎牛血清组细胞活性值显著升高(Plt;0.01)，说明10%胎牛血清组能够明显促进CFBs增殖；不同浓度(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)的ALD均能提高CFBs的活性，显著高于对照组(Plt;0.01，Plt;0.05)；10-6mol/L ALD促进CFBs增殖水平与10%胎牛血清组比较无显著差异，见图1。结果显示，ALD呈浓度依赖性地促进CFBs的增殖。

Figure 1. The viability of CFBs induced by ALD±s.n=3.*Plt;0.05,**Plt;0.01 vs control (without treatment).

2IMD1-53对ALD诱导CFBs胶原蛋白合成的影响

与含1%血清对照组比较，CFBs在10-6mol/L ALD的作用下羟脯氨酸含量明显升高(Plt;0.01)，说明10-6mol/L ALD可显著促进CFBs的胶原蛋白合成。CFBs在10-6mol/L ALD的作用下分别加入浓度为10-9mol/L IMD1-53、10-8mol/L IMD1-53、10-7mol/L IMD1-53后，与10-6mol/L ALD组比较，羟脯氨酸含量呈浓度依赖性下降(Plt;0.01，Plt;0.05)，见图2。结果显示，IMD1-53呈浓度依赖性地抑制ALD诱导CFBs胶原蛋白合成。

3ALD对CFBs的ERK磷酸化激活的影响

ALD作用CFBs 5 min、10 min和30 min时与对照组比较p-ERK蛋白表达均有显著差异(Plt;0.01)。且在10 min时达最高值，见图3。结果显示，ALD对CFBs的ERK磷酸化激活在10 min之内逐渐增强，之后又逐渐下降。

4IMD1-53对ALD诱导CFBs的p-ERK蛋白表达的作用

ALD组的p-ERK蛋白表达量与对照组比较明显升高(Plt;0.05)，ALD+IMD组蛋白表达量与ALD比较明显降低 (Plt;0.05),见图4。结果显示，IMD1-53明显抑制ALD诱导CFBs的p-ERK蛋白的表达。

Figure 2. Effect of IMD1-53 on ALD-induced collagen synthesis in cultured CFBs. Intracellular collagen level was measured by measuring hydroxyproline in the supernatants. ±s.n=3.**Plt;0.01 vs control(without treatment);#Plt;0.05,##Plt;0.01 vs ALD (10-6 mol/L) alone.

Figure 3. Expression of p-ERK protein in rat CFBs±s.n=3.*Plt;0.05,**Plt;0.01 vs control.

Figure 4. Expression of p-ERK protein in rat CFBs±s.n=3.**Plt;0.01 vs A group；#Plt;0.05 vs B group.

讨 论

心肌重构(包括心肌细胞和细胞外基质重构)是心力衰竭的主要病理基础，心肌损伤后，大量细胞因子参与了修复重构过程[5，6]，而心肌纤维化是心肌重构的重要形成原因[7]。随着我国冠心病、心肌梗死、高血压等发病率的上升，心肌肥厚以及心肌间质纤维化的发生也在增多，因此阻止或逆转纤维化是延缓心力衰竭，减少心律失常发生的重要手段。

已有的研究发现IMD具有明显舒张血管、降低血压、加快心率作用[8]；对缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用[9]；具有调节新生大鼠肥大心肌细胞的作用[10]；对离体大鼠的心脏具有正性肌力和增加冠脉流量的作用[4]；对肾性高血压大鼠[11]和肾衰竭大鼠[12]也具有调节作用。Smith等[13]发现IMD通过ERK、Akt/NOS/NO及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)信号通路促进血管内皮生长。Albertin等[14]发现IMD不仅可通过降钙素受体样受体/受体活性修饰蛋白(calcitonin receptor-like receptor/receptor activity-modifying proteins,CLR/RAMPs)诱导血管内皮生长因子释放，而且还可通过反式激活血管内皮生长因子受体系统来诱导人体血管内皮细胞的促血管生成反应。

本实验结果显示，ALD明显刺激细胞增殖，IMD1-53对基础状态下的CFBs无明显抑制作用。在ALD作用的情况下，IMD1-53呈浓度依赖性抑制ALD刺激的CFBs增殖，提示IMD1-53可作为心肌纤维化的抑制因子，以对抗心肌纤维化形成过程中刺激因子的作用，且具有浓度依赖效应。

ERK通路是MAPK途径中最经典、研究最透彻的通路，该通路是多种促增殖信号转导途径的节点和共同通路。在本实验中IMD1-53改善了ALD诱导的CFBs增殖和胶原合成，但IMD1-53的这种作用是通过何种信号转导机制目前尚不清楚。本实验结果表明在ALD刺激下，CFBs中p-ERK的表达明显高于对照组，且在ALD作用10 min时p-ERK表达最强，而CFBs中ERK的表达未见变化。提示ALD诱导的CFBs增殖是通过ERK的磷酸化而实现的。在以10-7mol/L IMD浓度预先干预下，再加入ALD共同作用后，p-ERK的表达呈下降趋势；而ERK的表达在各组中均未见变化，由此可知抑制ERK的磷酸化是IMD抑制ALD诱导的CFBs增殖和胶原合成的信号通路之一，即是逆转心肌纤维化的分子生物学机制。IMD在血管内皮细胞中可诱导细胞迁移和血管形成，这些作用又可通过抑制ERK等信号通路而被阻止[13]。总之这些结果显示IMD可以通过抑制ERK的磷酸化来抑制心肌成纤维细胞增殖，而在血管内皮细胞中IMD可通过ERK信号通路加强血管再生。

综上所述，IMD1-53可呈浓度依赖性地抑制ALD诱导的CFBs的增殖，IMD1-53可以通过下调p-ERK表达抑制ALD诱导的CFBs增殖，从而减缓心肌纤维化。

[1] Roh J,Chang CL,Bhalla A,et al.Intermedin is a calcitonin/calcitonin gene-related peptide family peptide acting through the calcitonin receptor-like receptor/receptor activity-modifying protein receptor complexes[J].J Biol Chem, 2004,279(8):7264-7274.

[2] Takei Y,Inoue K,Ogoshi M,et al. Identification of novel adrenomedullin in mammals:a potent cardiovascular and renal regulator[J].FEBS Lett,2004,556(1-3):53-58.

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[13]Smith RS Jr, Gao L, Bledsoe G, et al. Intermedin is a new angiogenic growth factor[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297(3):H1040- H1047.

[14]Albertin G, Sorato E, Oselladore B, et al.Involvement of vascular endothelial growth factor signaling in CLR/RAMP1 and CLR/RAMP2-mediated pro-angiogenic effect of intermedin on human vascular endothelial cells[J].Int J Mol Med，2010,26(2):289-294.

成年小鼠海马齿状回存在有别于室管膜区神经干细胞的定向祖细胞种群

目前关于在成年哺乳动物海马区是否存在神经干细胞仍存在争论。同源细胞集落形成测定可观察单细胞发展成具有干细胞自我更新功能和多潜能的细胞的过程。在体外实验中，加拿大科学家发现来自成年小鼠侧脑室室管膜下区(SEZ)的单细胞可形成大量具有自我更新与多潜能的细胞集落，但来自成年小鼠海马区齿状回(DG)的单细胞则产生较少、无自我更新能力及仅单向发展的集落。在DG结构形成之前，能分离到具有长期自我更新与多潜能的集落的区域仅存在于早期胚胎的海马。未见祖细胞从后生的SEZ向新形成的DG亚粒状区域移动。体外实验中成熟的DG集落来源于胚胎期的海马原基。有关胚胎海马区神经干细胞随着器官年龄增加而发生特性改变这一模型也得到实验的证实。当用成年小鼠DG 球状体细胞与胚胎脑组织切片共同培养，可使DG 球状体细胞的自我更新功能(而不是多潜能的功能)得以恢复，该功能在撤除共培养的胚胎脑组织切片后仍能维持数代。用成年小鼠克隆的DG 球状体细胞种植于胚胎脑组织切片或移植入新生鼠脑内不会产生神经元，培养分离的小集落产生的神经元比体外实验中用球状体集落产生的神经元的数量大约多十倍，可能是在成年小鼠体内有维持神经发生功能的缘故。同时，在用微解剖和单细胞培养的体外实验中，DG神经前体细胞从胚胎到成年的集落形成测定发现，DG集落逐渐失去多潜能及自我更新能力，直至成年神经胶质细胞出现，即DG神经前体细胞不是神经干细胞，有别于室管膜下区(SEZ)的神经干细胞。作者推测成年小鼠海马区分别存神经胶质集落与神经元集落，在观察成年海马区神经胶质细胞的增殖时应将神经胶质集落与神经元集落分开培养。

Stem Cells, 2011, 29(9):1448-1458(李学敏)

Effectofintermedin1-53onaldosterone-inducedcardiacfibroblastproliferation

XUE Li-hua1, LIANG Ying1, SONG Jun-qiu2, QI Yong-fen2, JIA Yue-xia1

(1DepartmentofPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences，NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China;2DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,PekingUniversityHealthScienceCenter,Beijing100083,China.E-mail:jiayuexia@163.com)

AIM: To investigate the roles of intermedin1-53(IMD1-53) and exteracellular signal-regulated kinase (ERK) signal pathway in the proliferation of rat cardiac fibroblasts (CFBs).METHODSIsolated and cultured CFBs from new born SD rats were randomly divided into control group, aldosterone (ALD) groups (at different concentrations) and ALD+IMD groups (IMD at different concentrations). The viability of CFBs was determined by MTT assay. Western blotting was used to observe the effect of IMD on ALD-induced ERK phosphorylation.RESULTSIMD1-53had no significant effect on the proliferation of CFBs in basal state, but inhibited the CFBs growth stimulated by ALD in a concentration (10-9～10-7mol/L)-dependent manner. IMD1-53also inhibited ERK phosphorylation stimulated by ALD in a concentration (10-9～10-7mol/L)-dependent manner.CONCLUSIONIMD1-53inhibits the proliferation of CFBs by ERK signal pathway.

Intermedin1-53; Cardiac fibroblast; Aldosterone; ERK pathway

1000-4718(2011)11-2056-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.002

2010-12-17

2011-09-13

国家自然科学基金资助项目 (No. 30860372)

△通讯作者 Tel:0951-6980093; E - mail: jiayuexia@163. com