原发性高血压患者ABCG4基因启动子的甲基化差异分析*

郭 军， 蔡 军， 李自成△

(1暨南大学附属第一医院心血管内科，广东 广州 510630；2首都医科大学附属北京朝阳医院心脏中心，北京 100020)

原发性高血压患者ABCG4基因启动子的甲基化差异分析*

郭 军1， 蔡 军2， 李自成1△

(1暨南大学附属第一医院心血管内科，广东 广州 510630；2首都医科大学附属北京朝阳医院心脏中心，北京 100020)

目的分析原发性高血压患者DNA启动子甲基化的差异，期待从表观遗传学的角度初步揭示人类原发性高血压的发病机制。方法实验对象分为正常对照组和原发性高血压组，提取外周血单个核细胞全基因组DNA。通过DNA甲基化芯片高通量筛选，共得到差异甲基化基因627个。筛选FZD7、LRP、TTBK1、USFP1、SYCE1、NDUSF8、ZNF540和ABCG4共8个可能与高血压相关基因，并进行后续亚硫酸氢盐测序PCR分析。结果8个候选基因中，ABCG4差异甲基化程度最为显著。原发性高血压组ABCG4基因启动子区甲基化率为18.3%，正常组为32.4%,两者差异显著(Plt;0.01)。结论本研究证实原发性高血压患者ABCG4基因启动子低甲基化，可能在原发性高血压的发病机制中起到一定的作用。

甲基化； 高血压； 启动子; 基因，ABCG4

近年来通过对疾病的表观遗传学机制研究包括染色质重塑、DNA甲基化及组蛋白修饰、X染色体失活、非编码RNA调控等，已经让我们了解了表观遗传机制、基因表达和环境之间的关系，并期望能纠正或降低那些能够导致疾病的表观基因的不稳定性，指导疾病的诊治和新药的研制[1]。高血压是心脑血管疾病发生的主要风险因素，而近90%的原发性高血压病因不明。近年来，研究者们试图从遗传学改变如单核苷酸多态性的角度寻找原发性高血压的病因[2]，虽然已经有所发现，但是这些因素均未能揭示大部分的原发性高血压患者的发病原因。 因此，本实验通过结合甲基化芯片筛选及亚硫酸氢盐测序PCR的方法分析原发性高血压患者DNA启动子甲基化的差异，期待从DNA甲基化的角度初步揭示人类原发性高血压的发病机制。

材 料 和 方 法

1研究对象

本实验分正常对照组和原发性高血压组，其中正常组4例，原发性高血压组6例，抽取外周静脉血，采用淋巴细胞分离液离心分离提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。纳入对象排除继发性高血压、其它心脏疾病、脑血管疾病、糖尿病以及其它合并症。基本资料见表1。该实验通过医院伦理委员会批准。

2全基因组DNA抽提

抽取患者清晨空腹状态下静脉血，置于EDTA血常规管，收集单个核细胞，采用DNA提取试剂盒(DNeasy Blood amp; Tissue Kit,QIAGEN)抽提全基因组DNA，并储存于-80 ℃至下一步实验。

表1 研究对象的基本资料

3DNA甲基化芯片高通量筛选

用美国 EZ DNA Methylation Kit 将DNA 中未甲基化CG 岛的C 转化为T。基因组 DNA 经NaOH 变性后，加入含引物的MA2(Multi Sample Amplification 2 Mix)和含酶的MSM(Multi Sample Amplification Master Mix)，于37℃孵育20-24 h完成扩增。扩增好的 DNA 中加入FMS(Fragmentation Solution)，37 ℃酶切1 h。加入含盐份溶液PM1 和异丙醇，使片段化的DNA 沉淀。加入含对照 DNA 的RA1 于48 ℃放置1 h，使其充分悬浮。悬浮的DNA 变性后加到芯片上，48 ℃杂交箱中杂交16-24 h。将芯片分别浸泡在WB1 和PB1 溶液中1 min，将未杂交的和非特异杂交的DNA 洗去为染色做好准备，组装好杂交舱。以杂交在芯片上的DNA 为模板，加入TEM(含SBE 酶、biotin-dNTP和DNP)使芯片微珠上的寡核苷酸链完成单碱基延伸；加入95%甲酰胺/1 mmol/L EDTA，去除目标DNA，芯片上仅留微珠上的单链探针。加入LTM和ATM，完成染色过程。将芯片浸泡在PB1中洗涤后浸泡在XC4 溶液中保护，最后将芯片放在真空干燥器内干燥，等待扫描。扫描仪通过双色激光激发微珠上的荧光基团，扫描得到杂交信号，软件自动分析给出代表甲基化程度值。

4亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfitesequencingPCR，BSP)

全基因组DNA样品各取约500ng，用MethylCode Bisulfite Conversion Kit(Invitrogen)对基因组DNA进行甲基化处理，并纯化、回收。用合成好的引物和处理过的基因组DNA进行PCR扩增。引物序列详见表2。切胶回收PCR产物。将回收的PCR产物与pMD18-T(TaKaRa)连接，室温连接2 h。取10 μL连接产物转化DH5α感受态细胞，涂皿(Amp+)，37 ℃培养过夜。每个平板挑10个克隆进行菌落PCR鉴定；将菌落PCR呈阳性的克隆接种于4 mL LB液体培养基中，37℃过夜培养。用质粒小量提取试剂盒(Axygen)提取质粒。质粒测序，测序结果采用BiQ Analyzer甲基化分析专用软件比对。

表2 亚硫酸氢盐测序PCR采用的引物序列信息

5统计学处理

结 果

1DNA甲基化芯片高通量筛选结果

本实验将正常组与疾病组芯片上全基因组甲基化探针的数据进行比较，利用t检验计算探针的显著水平，共得到差异甲基化基因627个，其中甲基化程度升高的基因位点有132个，甲基化程度低的基因位点有495个。原发性高血压全基因组的DNA甲基化芯片高通量筛选结果见图1。

Figure 1. DNA methylation chip results of chromosomes(Chr) in human primary hypertension. Dense green sites indicate hypermethylation.

2亚硫酸氢钠测序PCR

在差异甲基化基因中选取FZD7、LRP、TTBK1、USFP1、SYCE1、NDUSF8、ZNF540和ABCG4共8个可能与高血压相关的基因，并进行后续BSP分析。结果发现8个候选基因中，ABCG4差异甲基化程度最为显著。原发性高血压组ABCG4基因启动子区甲基化呈相对低甲基化，启动子区甲基化率为18.3%(n=6)，正常组基因启动子区甲基化率为32.4%(n=4)；原发性高血压组ABCG4基因启动子区甲基化率比正常组基因启动子区甲基化率低14.1%(Plt;0.01)，见表3、图2。

表3 原发性高血压组与正常组基因甲基化程度

Figure 2. The methylation status of ABCG4 gene promoter. Open and closed circles indicate unmethylated and methylated CpGs,respectively. Fork site is undetermined. A: ABCG4 gene promoter methylation status in primary hypertension group；B: ABCG4 gene promoter methylation status in control group.

讨 论

原发性高血压的发生机制非常复杂，研究者们试图从遗传学改变如单核苷酸多态性的角度寻找原发性高血压的发病机制，虽然已经有所发现，但是仅能解释少数高血压的发病机制，而不能揭示大部分的原发性高血压患者的发病机制。

近年来，一系列的研究报道揭开了高血压表观遗传学机制的冰山一角。2007年Bogdarina等[3]发现高血压大鼠的血管紧张素II受体AT1b的基因及蛋白表达均显著上调，AT1b基因近端的启动子高度去甲基化。新近的临床及基础研究发现高血压患者2型11β-羟类固醇脱氢酶(11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase 2,11β-HSD2)基因的启动子区域和第1外显子的CpG岛高度甲基化[4, 5]。另外，内皮素转换酶(endothelin-converting enzyme，ECE-1c)的启动子区域的甲基化也被认为和高血压发生密切相关[6]。

从以上研究结果来看，由于采用的技术手段及研究者视角的局限，只是少数几个高血压相关基因被有所侧重地分析了DNA甲基化情况，迄今为止，尚未见到全面的对原发性高血压相关基因表观遗传学的研究报道。原发性高血压相关基因是一系列已知和未知的基因群，因此，结合国外同行的研究报道不难预测，对原发性高血压相关基因的DNA甲基化状态进行全面细致的分析是必要的。本研究高血压相关基因的甲基化筛查采用DNA甲基化芯片高通量筛选这一高通量表观遗传生物芯片新技术，使研究者对疾病组织异常的甲基化区域进行高通量快速筛选成为可能。另外，对初筛后的甲基化异常基因进行亚硫酸氢钠测序PCR，可以达到进一步精确细筛的目的。

本研究在627个差异甲基化基因中选取FZD7、LRP、TTBK1、USFP1、SYCE1、NDUSF8、ZNF540和ABCG4共8个高血压相关基因进行后续BSP分析。结果发现8个候选基因中，ABCG4差异甲基化程度最为显著。原发性高血压组ABCG4基因启动子区呈相对低甲基化，甲基化率比正常组低14.1%。ABCG4基因是膜转运蛋白ATP-结合盒(ATP-binding cassette, ABC)家族转运体中G族的第4个成员，定位于染色体11q23.3上，其功能可能被肝X受体和维甲酸X受体调节升高，并与调节胆固醇外排并转运到高密度脂蛋白中有关。业已证实ABC多药转运蛋白介导的药物外排对化疗药耐受起主要作用，但其它具体功能及其它特性仍不清楚[7, 8]。通过GenBank序列分析发现ABCG4基因启动子区域存在大量的CpG岛，并且本研究证实原发性高血压患者ABDG4基因启动子低甲基化，可以初步提示ABCG4基因低甲基化可能对ABCG4在原发性高血压的表达调控起一定作用，该研究仍需在功能学上进一步验证。

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AnalysisofabnormalmethylationinABCG4genepromoterinprimaryhypertension

GUO Jun1, CAI Jun2, LI Zi-cheng1

(1DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510630,China;2HeartCenter,BeijingChaoyangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China.E-mail:zichengli@163.net)

AIM: To analyze the variety of DNA promoter methylation and epigenetic pathogenesis of human primary hypertension.METHODSGenomic DNA was collected from peripheral blood mononuclear cells in normal control group and primary hypertension group. High-throughput screening of 627 diversely-methylated genes was performed by DNA methylation chip. The genes ofFZD7,LRP,TTBK1,USFP1,SYCE1,NDUSF8,ZNF540 andABCG4 were considered as candidate hypertension-related genes and they were analyzed with bisulfite sequencing PCR.RESULTSAmong 8 candidate genes,ABCG4 gene presented the most different DNA methylation. In primary hypertension group, the promoter ofABCG4 gene presented hypomethylation and the percentage of methylation was 18.3%, while that in normal control group was 32.4%(Plt;0.01).CONCLUSIONABCG4 gene promoter presents hypomethylation, suggesting that it may be related to the pathogenesis of primary hypertension.

Methylation; Hypertension; Promoter；Genes,ABCG4

1000-4718(2011)11-2067-05

R544.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.004

2011-05-30

2011-08-28

教育部留学回国人员科研启动基金资助项目(No.20101174)；暨南大学科研培育与创新基金资助项目(中央高校基本科研业务费专项资金资助，No.21610302)；广东高校育苗工程项目，广东高校优秀青年创新人才培养计划(No.LYM10030)；暨南大学第一临床医学院重点学科基金资助项目(暨一临【2010】4号)

△通讯作者 Tel:020-38688665；E-mail：zichengli@163.net