胆道外引流对大鼠肝再生的影响及其细胞周期调控机制

陈 东， 周 奇， 梁力建， 殷晓煜， 彭宝岗， 李绍强， 黄 力， 黄洁夫

(中山大学附属第一医院肝胆外科，广东 广州 510080)

胆道外引流对大鼠肝再生的影响及其细胞周期调控机制

陈 东， 周 奇， 梁力建△， 殷晓煜， 彭宝岗， 李绍强， 黄 力， 黄洁夫

(中山大学附属第一医院肝胆外科，广东 广州 510080)

目的观察胆道外引流(ED)对大鼠肝再生及肝细胞周期的影响。方法采用大鼠70%肝切除模型，SD大鼠随机分成6组，每组8只，分别为正常切肝24 h组、48 h组，阻塞性黄疸(OJ)切肝24 h组、48 h组，OJ后ED 3 d切肝24 h组、48 h组。采用增殖细胞核抗原(PCNA)标记和Feulgen染色测定肝再生能力；采用RT-PCR 测定肝组织肝细胞生长因子(HGF)、p27和cyclin D1 mRNA水平变化；免疫组化法测定HGF、转化生长因子β1(TGF-β1)和p21在肝细胞的表达。结果OJ切肝后PCNA标记指数较对照组低(Plt;0.05)，ED后PCNA标记指数更低，与OJ组对比差异显著(Plt;0.05)。DNA含量变化与PCNA标记指数相似。与正常切肝组比较，OJ后切肝组HGF mRNA下降(Plt;0.05)，ED后切肝组进一步下降并较OJ组低(Plt;0.05)。与正常组相比，OJ后切肝24 h和48 h cyclin D1 mRNA均下降(Plt;0.05，Plt;0.01)，ED后切肝组进一步下降，但差异不显著。与正常切肝组相比，48 h时OJ后切肝组高于正常切肝组(Plt;0.05)，ED后p27 mRNA水平较OJ进一步升高(Plt;0.05)。与正常切肝组比较，OJ后切肝组肝细胞HGF表达在24 h下降(Plt;0.05)，ED后切肝组进一步下降并较OJ组低(Plt;0.05)。p21表达各组间无显著差异。与正常切肝组相比，24 h时OJ后切肝组TGF-β1表达上调，差异显著(Plt;0.05)，ED后切肝组上调，但差异不显著。结论OJ可造成大鼠肝再生能力下降，ED后其肝再生能力进一步降低。ED后肝再生能力下降可能和HGF、p27密切相关，与TGF-β1、p21、cyclin D1无关。

黄疸，阻塞性； 胆道引流； 肝再生； 细胞周期

多数以70%肝切除大鼠模型的研究发现阻塞性黄疸后大鼠肝再生能力较正常下降，亦有促进肝再生的报道；多数动物实验认为术前胆道外引流(external drainage, ED)抑制肝切除后肝再生，亦有实验证实术前胆道引流对肝切除后肝再生无影响[1,2]，目前尚未有统一的结论；另外，目前尚缺乏阻塞性黄疸(obstructive jaundice, OJ)胆道引流后肝再生、肝细胞周期变化的研究。本研究旨在探讨阻塞性黄疸及胆道外引流后大鼠肝切除后肝再生能力变化及其肝细胞周期调控的机制。

材 料 和 方 法

1材料

纯系清洁级SD大鼠，雄性，体重250～320 g，中山大学实验动物中心提供。动物在中山大学附属第一医院动物实验中心清洁级动物实验室饲养，饲料由中山大学实验动物中心提供。人体医用硅胶管(内径1.0 mm，外径1.2 mm，上海精化医用橡胶厂)，逆转录试剂盒(Toyobo)，Taq DNA聚合酶(TaKaRa)，引物由上海生物工程研究所合成，兔抗鼠抗体p21(Santa Cruz，工作浓度1∶100)，兔抗鼠抗体肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)(Santa Cruz，工作浓度1∶200)，兔抗鼠抗体转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)(博士德生物工程公司，工作浓度1∶100)，免疫组化试剂盒(博士德生物工程公司)，PCNA检测试剂盒(博士德生物工程公司)，无色品红试剂，0.5%偏重亚硫酸钠水溶液，0.2%亮绿水溶液(亮绿0.2 g，蒸馏水100 mL溶解)，5 mol/L盐酸水溶液(比重1.19的浓盐酸42 mL，加至蒸馏水100 mL中溶解)，火棉胶液(火棉胶0.5 g，无水乙醇50 mL，乙醚50 mL)，Kontron IBAS 2.5 全自动图像分析系统，Beckman DU640紫外分光光度计,PE480基因扩增聚合酶链式反应系统(PE)，SK-100型凝胶紫外分析仪，IBAS(Interactive Build Analysis System)图像处理系统(Carl Zeiss)。

2方法

2.1实验分组 实验动物随机分为6组，每组8只，分别为A组：正常切肝24 h处死组：正常大鼠切除70%肝脏，24 h后处死；B组：正常切肝48 h处死组，同A组切肝48 h后处死；C组：OJ 7 d切肝24 h处死组，采用经典OJ模型，OJ 7 d后切除70%肝脏，24 h后处死；D组：OJ 7 d切肝48 h处死组，同C组切肝48 h后处死；E组：ED 3 d切肝24 h处死组，采用改进OJ模型，OJ 7 d后开放末端结扎形成胆道外引流，3 d后切除70%肝脏，24 h后处死；F组：ED 3 d切肝48 h处死组，同E组切肝48 h后处死。各组大鼠处死前1 d禁食不禁水，清晨处死动物，切取约1.5 g肝组织10%甲醛固定，石蜡包埋后待检，在肝右叶同一部位切除1.5 g肝组织，迅速放入液氮罐中，24 h后转入-80 ℃备测。

2.2手术方法

① 经典OJ模型 大鼠术前1 d放入鼠笼中适应环境并禁食，可饮水。术前称体重，水合氯醛麻醉后大鼠仰卧固定，碘酒、乙醇消毒腹部，上腹正中切口开腹，找到胆总管(common blie duct，CBD)，距离左、右肝管汇合处以下0.5 cm结扎CBD，双重结扎，中间离断造成OJ模型，关腹。

② 改进OJ模型和ED方法[3]胆总管置入硅胶管，插入CBD置距离左、右肝管汇合处约0.2 cm，插入至少0.5 cm，双重5-0丝线结扎固定，胆总管另一端结扎关闭。将插入的硅胶管小心引出体外，肌肉处、引出腹壁处均妥善固定好，通过皮下隧道引出至大鼠颈部背侧皮下固定，末端用线扎紧，埋入皮下。造成ED时，从皮下取出硅胶管开放，外接橡胶手套制成的引流袋，妥善结扎固定。

③ 70%肝切除(partial hepatectomy) 术前30 min腹腔注射阿托品0.03～0.05 mg，乙醚麻醉后大鼠仰卧固定，碘酒、75%乙醇消毒腹部切口，从原切口开腹，参照Higginst等[4]法切除大鼠左侧叶与中叶(用5-0线结扎、切断肝脏)，ED组肝切除后将原胆道置管剪断，留约2～3 cm，十二指肠壁荷包缝合，戳洞后将管消毒并置入十二指肠，切面止血后关腹。分笼喂养，灯下过夜。

2.3Feulgen染色测DNA含量 切片脱蜡至水，入5 mol/L盐酸于室温下水解40 min，直接转入无色品红液，于室温下置暗处作用60～90 min，不经水洗，直接滴入0.5%偏重亚硫酸钠水溶液洗2次，每次1 min，流水洗5 min；0.2%亮绿水溶液复染40 s，水洗30 min，常规脱水透明，中性树胶封固。DNA呈紫红色，胞质和其它组织成分绿色。采用Kontron IBAS 2.5 全自动图像分析系统，在200倍视野下每张玻片随机选取3个视野，测定每个视野的阳性反应物的灰度Gα及面积Aα，选定区域的平均面积A及平均灰度GA，将图像转化为量化单位，用“阳性单位(positive unit, PU)”表示，参照文献介绍的公式计算PU[5]。PU=[| Gα- GA|/(1-AAα)×Gmax] ×100，AAα为阳性反应物的面积密度，AAα= Aα/A。Gmax为仪器的最大灰度。PU值越大，表示DNA相对含量越高。

2.4逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测HGF、cyclin D1和p27 mRNA 用oligo软件辅助设计引物，引物序列见表1。PCR反应参考TaKaRa Ex Taq(DRR100A)说明书进行，各基因退火温度见表1。

表1 RT-PCR 引物序列

2.5免疫组化染色检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、HGF、TGF-β1和p21 将所有标本连续切片6张，厚度4 μm，收取组织后切片置入恒温箱60 ℃下烤片1 h，使组织在玻片上充分展开并紧密黏附。PCNA检测参照试剂盒说明书进行，HGF、TGF-β1和p21检测采用免疫组化SABC法，试验步骤按免疫组织化学SABC试剂盒说明书进行。

PCNA参照文献[6]以核表达为阳性表达细胞，随机选取5个高倍视野(×400)，每个视野计数500个细胞，计算阳性细胞平均数，换算成百分比，为PCNA标记指数(labeling index, LI)。HGF的表达以胞浆表达为阳性表达细胞，TGF-β1的表达以胞浆表达为阳性表达细胞，p21表达以核表达为阳性表达细胞，随机选取5个高倍视野(×400)，每个视野计数200个肝细胞，计算阳性细胞平均数，换算成百分比，分别为HGF 、TGF-β1、p21标记指数。

3统计学处理

结 果

1肝组织PCNA和DNA含量(Feulgen染色)的变化

70%肝切除后各组的PCNA表达变化为，对照组切肝24 h及48 h后PCNA LI均下降，48 h较24 h为低。OJ切肝后PCNA LI较对照组低(Plt;0.05)，ED后PCNA LI更低，与OJ组对比差异显著(Plt;0.05)。DNA含量变化与PCNA LI相似，见图1。

Figure 1. Statistical results of PCNA LI(A) and DNA content(B) after 70% partial hepatectomy in different groups±s.n=8,*Plt;0.05 vs control; #Plt;0.05 vs OJ group.

经相关分析，PCNA LI和Feulgen染色PU值两者呈正相关关系(r=0.458，Plt;0.05)。

2大鼠肝组织HGF、cyclinD1和p27mRNA水平的变化

与正常切肝组比较，OJ后切肝组HGF mRNA在24 h下降(Plt;0.05)，ED后切肝组进一步下降并较OJ组低(Plt;0.05)，48 h变化类似。与正常组相比，OJ后切肝组cyclin D1 mRNA在24 h下降(Plt;0.05)，ED后切肝组进一步下降，但差异不显著，48 h时OJ后切肝组cyclin D1 mRNA与正常组相比亦下降(Plt;0.01)，ED后切肝组与OJ后切肝组相比亦下降，但无显著差异。与正常切肝组相比，OJ后切肝组p27 mRNA水平上调，但表达无差异，ED后切肝组上调，与OJ后切肝组相比差异显著(Plt;0.01)，48 h时OJ后切肝组高于正常切肝组(Plt;0.05)，ED后p27 mRNA水平较OJ进一步升高(Plt;0.05)，见图2、3。

3大鼠肝细胞HGF、p21和TGF-β1表达的变化

与正常切肝组比较，OJ后切肝组肝细胞HGF表达在24 h下降(Plt;0.05)，ED后切肝组进一步下降并较OJ组低(Plt;0.05)，48 h变化类似但ED后切肝组较OJ后切肝组下降无显著差异。p21表达在各组处于一个较低的相似的水平，见图4，各组间无显著差异。与正常切肝组相比，24 h时OJ后切肝组TGF-β1表达上调，差异显著(Plt;0.05)，ED后切肝组上调，但差异不显著，48 h OJ后切肝组和ED后切肝组变化类似，见图5。

讨 论

1胆道外引流对OJ大鼠肝再生的影响

本研究发现正常大鼠切除70%肝脏后24 h PCNA LI在较高水平，48 h下降，提示正常大鼠切肝后肝再生24 h达到峰值，48 h后下降；OJ大鼠切肝后24 h、48 h的PCNA LI与正常组相比显著降低，DNA含量存在同样的变化，显示阻塞性黄疸降低了大鼠肝切除后肝再生的能力。Ueda等[6]以PCNA作为指标得出相似的结果。本研究ED切肝后PCNA LI进一步降低，与OJ切肝组对比差异显著，显示与正常大鼠切肝相比，ED后大鼠肝再生能力进一步下降，提示ED并不能改善肝再生，反而起抑制肝再生的作用。Saiki等[7]在70%肝切除大鼠模型上利用DNA合成率作为肝再生指标，证明阻塞性黄疸后大鼠肝再生能力下降，胆道外引流后切肝大鼠的肝再生能力进一步下降，且内引流可以使大鼠肝再生能力增强，认为在改善肝再生能力上内引流的作用要优于外引流。这个过程可能和胆汁的流失有关。胆汁酸是胆汁的主要成分，Barone等[8]利用大鼠肝切除模型，证实进食富含胆汁酸成分食物的大鼠肝再生能力较禁食普通食物大鼠强；而当胆汁酸大量流失后，由于代偿作用肝脏大量合成胆汁酸使肝合成胆固醇的能力下降，而肠道内胆汁缺乏造成胆固醇合成进一步下降，胆固醇属于对于肝切除后肝再生有用的物质；对正常大鼠肝脏胆道外引流7 d后肝再生能力亦下降，这可能由于胆汁内含对肝再生有重要作用的物质[6]。目前对于胆汁成分对肝脏的作用研究甚少，还不明确究竟是胆汁中的何种成分、通过何种机制发挥加强肝再生的作用。

2胆道外引流对OJ大鼠肝再生的细胞周期调控机制

与正常切肝组相比，OJ组HGF和cyclin D1 mRNA在24 h和48 h均较低，提示阻塞性黄疸后肝再生能力下降可能与HGF和cycliln D1 mRNA转录水平的变化相关。这个结果提示，对于肝再生来说，HGF是非常重要的一个因子。Makino等[9]发现大鼠OJ切肝后HGF mRNA的达峰期较正常对照组延迟，正常对照组切肝后12 h HGF mRNA达峰，而OJ后切肝达峰时间延迟到72 h；同时单纯阻塞性黄疸可使HGF mRNA水平升高，同时PCNA LI升高。本研究亦发现cyclin D1 mRNA在正常对照组48 h较24 h高，而OJ组48 h虽亦有上升，但差异不显著。ED切肝后大鼠HGF mRNA水平进一步下降，而cyclin D1 mRNA变化不大，提示ED导致OJ大鼠肝再生能力进一步下降可能和HGF关系较密切，而与cyclin D1无关。Cyclin D1由多种途径可以调节，Nakano等[10]证实，内引流改善OJ大鼠肝再生能力的过程与cyclin D1无关，而可能和CCCAT/enhanced binding protein(C/EBP)-α、cycliln E途径相关。外引流抑制OJ大鼠肝再生能力的过程可能与此类似，也与cyclin D1无关。

Figure 3. Quantitative analysis of HGF(A), cyclin D1(B) and p27(C) mRNA expression after 70% partial hepatectomy in different groups±s.n=8.*Plt;0.05,**Plt;0.01 vs conrol;#Plt;0.05，##Plt;0.01 vs OJ group.

切肝24 h，OJ组和对照组p27 mRNA水平表达无差异，48 h OJ组显著高于对照组；ED切肝后p27mRNA水平较OJ进一步升高，24 h、48 h均具有显著差异(Plt;0.05，Plt;0.01)。这个结果提示p27可能参与OJ大鼠肝再生抑制的细胞调控机制；ED后OJ大鼠肝再生进一步抑制的机制可能和p27存在较大关系。Ueda等[6]发现内引流后阻黄大鼠肝再生改善，而外引流肝再生抑制机制与cyclin E相关激酶活性上升有关。p27和cyclin E关系密切，与p21相比，p27对肝再生的作用可能更具影响。比较p21、p27基因敲除对肝再生的影响，发现小鼠肝细胞数目的增长只和p27基因敲除相关；另外从p27基因敲除小鼠分离出肝细胞，发现其具有强大的再生、增殖能力，且机制与cyclin E相关激酶的活性变化相关[11]。

Figure 4. Immunohistochemical staining of p21 after OJ and partial hepatectomy (×200). Low level expression of p21 in hepatocytes was observed.

Figure 5. Quantitative analysis of HGF(A)，TGF-β1(B) and p21(C) protein expression detected by immunohistochemical staining after 70% partial hepatectomy in different groups±s.n=8.*Plt;0.05 vs control; #Plt;0.05 vs OJ group.

本实验发现，OJ切肝后24 h、48 h TGF-β1表达上升，较正常对照组有显著差异，这个结果和Makino等[9]的研究相似，因此其认为阻塞性黄疸后肝再生降低主要是HGF延迟到达峰值和TGF-β1高表达的缘故。TGF-β1一般被认为是肝再生的负性调节因子，细胞培养实验证明，TGF-β1可以抑制肝细胞的再生；OJ大鼠注射TGF-β1可以使OJ大鼠肝切除后降低的肝再生能力恢复，同时肝功能指标得到改善[12]，提示TGF-β1是阻塞性黄疸肝再生抑制过程中的另外一个重要的因子。本实验结果提示ED切肝后TGF-β1与OJ组相比无显著差异，提示在外引流抑制肝再生的细胞周期调控机制中TGF-β1不起主要作用。

p21表达在各组相似，提示p21不参与阻塞性黄疸和外引流导致肝再生变化的机制。但Albrecht等[13]利用Western blotting检测发现，大鼠肝切除后肝再生的过程中p21下降，但他的实验是分离肝切除后大鼠的肝细胞，且与阻塞性黄疸过程无关。

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Effectofexternalbiliarydrainageonliverregenerationandregulatorymechanismofcellcycleinrats

CHEN Dong,ZHOU Qi, LIANG Li-jian, YIN Xiao-yu, PENG Bao-gang, LI Shao-qiang, HUANG Li, HUANG Jie-fu

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:lianglj@medmail.com.cn)

AIM: To investigate the effect of external biliary drainage on the liver regeneration and the regulatory mechanism of cell cycle in rats.METHODSThe SD rats were used to establish the model of 70% partial hepatectomy (PH). The rats were divided into 6 groups, including normal rats with PH for 24 h or 48 h, obstructive jaundice (OJ) rats with PH for 24 h or 48 h and external drainage (ED) rats with PH for 24 h or 48 h. PCNA labeling index (LI) and DNA content (Feulgen staining, PU value) were measured. The mRNA expression of hepatocyte growth factor(HGF), p27 and cyclin D1 was detected by RT-PCR. The protein levels of p21, HGF and transforming growth factor β1(TGF-β1) in hepatocytes were determined by the method of immunohistochemistry.RESULTSThe PCNA LI in OJ rats after PH was lower than that in control groups (Plt;0.05) and was further lower in ED groups compared with OJ groups (Plt;0.05). The PU value of Feulgen staining was positively correlated with PCNA LI. The mRNA level of HGF in OJ rats was significantly lower (Plt;0.05) than that in control groups, and further lower in ED groups (Plt;0.05) than that in OJ groups. Compared with control groups, the mRNA level of cyclin D1 was lower at 24 h and 48 h (Plt;0.05,Plt;0.01) in OJ rats, and was further lower after ED, but the changes were not statistically significant. Compared with control group, the changes of p27 mRNA was significantly higher at 48 h (Plt;0.05) in OJ rats and even higher after ED (Plt;0.05). The expression of HGF in OJ rats was lower at 24 h (Plt;0.05) compared with control group, and was further lower (Plt;0.05) after ED compared with OJ group. The expression of TGF-β1was increased in OJ rats compared with control groups (Plt;0.05) and further increased after ED, but there was no statistical significance between OJ groups and ED groups. No difference of p21 expression among groups was observed.CONCLUSIONLiver regeneration is inhibited by OJ and further impaired after ED. The inhibition of Liver regeneration is associated with HGF and p27, but not with TGF-β1, p21 and cyclin D1.

Jaundice,obstructive; Biliary drainage; Liver regeneration; Cell cycle

1000-4718(2011)11-2199-06

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.031

2011-04-11

2011-09-28

△通讯作者 Tel:020-87755766-8214; E-mail:lianglj@medmail.com.cn