丝瓜提取物抗氧化活性的研究*

潘永勤， 李 菁， 朱伟杰， 贺惠娟

(暨南大学1医学院病理生理学系，2生命科学技术学院生殖免疫研究所，广东 广州 510632)

丝瓜提取物抗氧化活性的研究*

潘永勤1#， 李 菁1△， 朱伟杰2， 贺惠娟1#

(暨南大学1医学院病理生理学系，2生命科学技术学院生殖免疫研究所，广东 广州 510632)

目的分离提取丝瓜抗氧化活性成分，观察其抗氧化效应。方法应用溶剂萃取法及葡聚糖凝胶柱层析法分离提取丝瓜抗氧化活性物质，通过测定不同提取物的抗氧化能力，筛选出丝瓜的抗氧化活性成分。结果由溶剂萃取法获得丝瓜提取物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，其中提取物Ⅲ抑制DPPH·和OH·自由基效果显著。提取物Ⅲ经柱层析进一步分离，得到A、B、C、D、E 5种组分，其中组分D、E抑制DPPH·和OH·自由基效果最显著，经鉴定提取物符合黄酮类物质特性。结论丝瓜具有清除自由基的作用，且主要作用物质为黄酮类物质。

丝瓜； 抗氧化； 黄酮类； 自由基

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是心脑血管疾病的病理基础。人体及动物实验均显示应用降血脂、抗氧化药物或食物补充剂可降低LDL水平、减轻LDL氧化修饰，从而延缓AS的发展[1-3]。

丝瓜(Luffacylindrica,LC)作为食用蔬菜在我国广泛种植，并以丝瓜络的形式应用于中药方剂中，具有清热解毒之功效。现代药理学研究显示丝瓜具有抗真菌、抗艾滋病病毒、免疫调节等作用[4-6]。本课题组的前期工作揭示，丝瓜络具有降血脂及减轻心肌缺血性损伤的作用，新鲜丝瓜亦有降血脂及抗氧化功效[7-10]，但具体的作用机制尚未清楚，丝瓜所含的抗氧化活性物质很可能是其作用基础。本项工作应用溶剂萃取法和葡聚糖凝胶柱层析法分离提取丝瓜抗氧化活性成分，为丝瓜作为抗AS药物开发应用提供参考资料。

材 料 和 方 法

1试剂

1,1-二苯基-2-苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picryl-hydarzyl, DPPH·)购自Sigma；维生素C (vitamine C，Vit C)购自北京普博欣公司；OH·测定试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司。

2丝瓜活性成分的提取

新鲜丝瓜50 g，搅碎，用70%丙酮400 mL浸泡、搅拌4 h。超声提取30 min，10 000×g离心10 min，收集上清。残渣再以70%丙酮超声提取30 min，重复2遍。合并上清液，减压浓缩后用100 mL双蒸水溶解得丝瓜初提液Ι。将初提液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取相减压浓缩，得石油醚相提取物Ⅱ，乙酸乙酯相提取物Ⅲ，正丁醇相提取物Ⅳ，水相提取物Ⅴ。

Sephadex LH-20 柱层析：0.6 g乙酸乙酯相提取物Ⅲ上样，甲醇洗脱(0.5 mL/min)，每10 mL为一馏分，共收集30馏分。每一馏份取5 μL, 点样于薄层硅胶预制板上，以氯仿-甲醇(9∶1)为展开剂，展开。晾干，碘显色，根据薄层色谱法(thin-layer chromatography，TLC)将洗脱馏份分为A、B、C、D、E 5个组份。

3DPPH自由基抑制作用的测定

DPPH·为稳定的自由基，在517 nm处有最大吸收。当有供氢能力的抗氧化剂存在时，DPPH·的单电子被配对而使其溶液颜色变浅，吸光度值变小，以吸光度的变化反映抗氧化剂活性[12]。提取物对DPPH·的抑制作用按文献所述方法进行[13]。

4羟自由基(OH·)抑制作用的测定

利用Fenton反应产生羟自由基的原理进行测定，规定每毫升样品液在37 ℃下反应1 min，使反应体系中H2O2浓度降低1mmol/L为1个抑制羟自由基能力单位,测定步骤按试剂盒说明进行[14]。

5提取物的鉴定

利用1%三氯化铝显色反应对丝瓜提取物进行初步鉴定[15]。

6统计学处理

结 果

1丝瓜提取物对DPPH·的抑制作用

丝瓜提取物Ι、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ均对DPPH·有一定的抑制作用，其中提取物Ⅲ作用效果最显著。当Ⅲ浓度为1 g/L时，抑制率达100%，且在浓度范围0.25～1g/L内呈量效关系，见表1。

表1 丝瓜提取物抑制DPPH·能力的比较

2丝瓜提取物对OH·的清除作用

图1 为丝瓜提取物抑制OH·能力的比较，抑制能力强弱为：Ⅴgt;Ιgt;Ⅲgt;Ⅳgt;Ⅱ。其中水相提取物Ⅴ对OH·的抑制能力为(262±22)×103U/L，显著高于其余各相提取物(Plt;0.01)。

3SephadexLH-20柱层析

提取物Ⅲ经Sephadex LH-20 凝胶柱分离，得到5种产物，分别为提取物A、B、C、D、E，其中提取物D及E抑制DPPH·能力最强，且抑制效果比同剂量的Vit C显著，见表2。

图2 所示为5种提取物抑制OH·能力的比较，提取物E、D均有抑制效应。提取物E对OH·的抑制能力最强，达(272±15)×103U/L，且强于1 g/L Vit C。

4丝瓜提取物E、D显色反应

丝瓜提取物E、D经三氯化铝显色后呈现黄色斑点，紫外灯下观察可见强荧光，表明其为黄酮类物质。

Figure 1. The inhibitory effect of different solvent extracts from Luffa cylindrica on OH·. Concentration of each extract was 5 g/L. Extract Ι: crude extract; extractⅡ: ligarine extract; extract Ⅲ:acetic ether extract; Extract Ⅳ:n-butanol extract; extract Ⅴ: water extract±s.n=3.**Plt;0.01 vs extract Ι;##Plt;0.01 vs extract Ⅲ.

表2 提取物Ⅲ分离后5种组分抑制DPPH·能力比较

Figure 2. The inhibitory effect of the five fractions of extract Ⅲ from Luffa cylindrica on OH·. Concentration of each fraction was 5 g/L.A:fraction A; B: fraction B; C: fraction C;D: fraction D; E: fraction E; Vit C: vitamin C±s.n=3.**Plt;0.01 vs Vit C ;##Plt;0.01 vs fraction D.

讨 论

天然抗氧化物可有效地清除自由基，阻止脂蛋白发生氧化修饰，抑制脂质过氧化反应，从而抑制AS发生发展，预防心脑血管疾病。因此，寻找降血脂、抗脂蛋白氧化修饰的药物，尤其是天然抗氧化物对AS的防治有临床应用价值[16, 17]。

目前丝瓜或丝瓜络发挥体内外抗氧化的物质基础尚未清楚，从丝瓜获取抗氧化有效成分是研究开发丝瓜抗AS药物的基础。我们前期的研究已发现，丝瓜初提液中含有丰富的多酚[9]。多酚为天然抗氧化物，广泛存在于各种植物中，目前研究较多的有苹果多酚、茶多酚、花青素等。多酚具有抗炎、抑菌、抗癌、抗动脉粥样硬化等多种生物学活性，作用机制可能与其能够清除机体内过剩的自由基有关[19-22]。现已证实植物中多酚含量与其抗氧化能力呈量效关系[18]。因此，丝瓜的抗氧化效应亦可能是源于其所含的多酚类物质。

通过测定及比较不同阶段提取物抗氧化能力的差异，筛选抗氧化活性成分。丝瓜初提液Ι经不同溶剂萃取后，得到提取物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 4种产物。除石油醚相提取物Ⅱ外，其余各相提取物均对DPPH· 具有较强的抑制能力，其中乙酸乙酯相提取物Ⅲ的作用效果最显著。提取物Ⅴ及Ⅲ均对OH·具有较强的抑制作用，提取物Ⅴ为水相萃取物，其主要成分可能为Vit C,经显色反应检验，仅提取物Ⅲ符合黄酮类物质特征。因此，选取乙酸乙酯相提取物Ⅲ作进一步的分离。乙酸乙酯相提取物Ⅲ经凝胶柱层析后得5种产物：提取物A、B、C、D、E。其中提取物D、E对DPPH· 和OH·具有较强的抑制作用，且经显色反应可判定为黄酮类物质。黄酮类物质为多酚家族中的重要成员，同样具有抗炎、抗癌、抗动脉粥样硬化、减轻缺血再灌注损伤等作用，其作用机制与黄酮类物质的抗氧化活性密切相关。具有降血脂、抗氧化作用的大豆黄酮(soybeanisoflavone,SI)、茶多酚(teaployphone,TP)、桑色素(morine) 等黄酮类化合物为近年研究的热点。结合本课题组前期研究结果，丝瓜或丝瓜络调节体内脂质代谢、维持氧化还原稳态作用的物质基础很可能是黄酮类化合物。

综上所述，从丝瓜中分离得到的黄酮类物质可能是其发挥体内抗氧化作用的主要物质；丝瓜具有抗氧化效应，作为药物或食物补充剂开发利用并应用于预防或延缓AS具有较好的应用前景。今后的研究工作将进一步分离纯化丝瓜提取物D、E，以期获得单体化合物并进行化学结构鉴定，为研究开发丝瓜天然抗氧化药物提供实验依据。

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AntioxidativeactivityofextractsfromLuffacylindrica

PAN Yong-qin1, LI Jing1, ZHU Wei-jie2, HE Hui-juan1

(1DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,2InstituteofReproductiveImmunology,CollegeofLifeScienceandTechnology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tlijing62@126.com)

AIM: To isolate the active compounds ofLuffacylindricaand investigate their antioxidative activity.METHODSAntioxidants fromLuffacylindricawere isolated using solvent extraction and Sephadex column chromatography. Active compounds of the extracts were identified with the antioxidative activity assays.RESULTSWith solvent extracting procedure, four extracts (Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ) were obtained. Among these extracts, extract Ⅲ had significant antioxidative activity, which exerted a potent scavenging effect for both DPPH· and OH· assays. For further purification, extract Ⅲ was subject to Sephadex column and five fractions ( A, B, C, D and E ) were isolated. Fraction D and E showed good efficiency on scavenging DPPH· and OH·, and exhibited flavanoid characteristics.CONCLUSIONLuffacylindricaefficiently scavenges free radical species, and flavanoid exerts this action.

Luffacylindrica; Antioxidation; Flavones; Free radicals

1000-4718(2011)11-2086-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.008

2011-05-25

2011-09-09

广东省中医药管理局资助项目(No.粤中医[2004]26号)；国家中医药管理局三级实验室开放课题基金资助项目

△通讯作者 Tel:020-85220253;E-mail:tlijing62@126.com

# 现工作单位：广东省水电二局医院(潘永勤)；湖北中医学院(贺惠娟)