shRNA-Survivin基因对A549细胞增殖、迁移和凋亡的影响

吴呈霖 王梅芳 雷怀定

近50年来，肺癌的发病率和死亡率逐年增加，已经超过其他肿瘤，成为威胁人类健康的“杀手之一”[1]。据人群统计学大数据显示，在男性人群中，肺癌的发病率和死亡率占所有恶性肿瘤的第一位；在女性人群中，肺癌占据第二位[2]。目前肺癌的治疗以手术为主，但术后复发率高，效果不佳[3]。因此，寻找更好的基因治疗靶点，为临床上肺癌患者提供新的治疗思路，仍然具有十分重要的意义。

RNA干扰(shRNA)技术可以有效沉默基因表达，该过程主要通过双链RNA(dsRNA)使目标基因相应的mRNA选择性失活得以实现的[4]。shRNA干扰技术是通过短反义核酸锁定细胞mRNA，从而实现其随后的降解。其反过来又阻断了该蛋白的进一步表达/聚集，导致其水平下降，抑制基因表达[5]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，Survivin具有肿瘤特异性，只表达于肿瘤和胚胎组织，且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关。有研究发现Survivin基因在鼻型NK/T细胞淋巴瘤的发病发展过程中具有高表达的特性，并且与p53、bcl-2蛋白的表达具有相关性[6]。本文旨在探讨shRNA干扰 Survivin质粒对肿瘤细胞的增殖，凋亡和迁移的影响。

资料与方法

一、实验材料

1. 肺腺癌细胞系A549的培养: 本实验以人肺腺癌细胞系A549为实验材料。所有细胞购自中科院上海细胞研究院。细胞经离心收集后，以2×104/cm2的密度将其种植于25×25 cm2的培养瓶中。加入含10%胎牛血清(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)的RPMI 1640培养液(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)，而后将细胞进行后续实验。

2. 构建shRNA干扰 Survivin慢病毒载体: sh RNA Survivin质粒由上海吉凯公司合成，选择pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro作为质粒的克隆载体。shRNA干扰 Survivin载体病毒载体的克隆切入点是XhoI/BamHI，编号为ENST00000003424。经过基因测序，从而证明序列的正确性。

三、实验方法

1. 实验分组: 将A549细胞分成3组，即空白对照组，空白病毒载体对照组和shRNA干扰 Survivin慢病毒载体组。空白对照组为未做任何处理的细胞组，空白病毒载体对照组是经空白载体的慢病毒转染的细胞组，shRNA干扰 Survivin组是由shRNA干扰 Survivin慢病毒的干扰载体构建的慢病毒转染细胞组。以ZsGreen为慢病毒荧光探针，用荧光显微镜观察细胞慢病毒的转染效率。

2. 实时荧光定量PCR检测: 3组细胞在融合率达80%以上后，用0.25%胰蛋白酶消化后放入15 ml离心管中，加入1 ml的Trizol RNAiso，裂解细胞，提取RNA后根据Takara逆转录试剂盒(DRR820A,Takara，日本)的说明书进行实验，将逆转录的cDNA保存在4 ℃冰箱中备用。根据Takara荧光定量PCR试剂盒的说明书的要求，采用20 μl的反应体系，加入各样品，进行荧光定量PCR的检测。采用FS2000系统对PCR进行分析，反应条件预设为预变性95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s， 40个循环。溶解曲线：95 ℃ 5 s； 60 ℃ 1 min。降温： 50 ℃ 30 s，1个循环。内参基因GAPDH和表皮成纤维细胞的标志物小鼠抗波形蛋白(Vimentin)引物由上海生工公司生产，见表1。采用2-△△Ct的方法计算目的基因的相对表达量。

表1 目的基因的引物序列

3. Western-blot检测: 3组细胞处理后，加入1 ml RIPA细胞裂解液，各组细胞在冰上裂解30 min，收集入1.5 ml的离心管中，在预冷4 ℃的离心机中离心，预设：以离心半径8 cm，5 000 r/min，离心5 min后提取上清，经95 ℃煮沸后，收集蛋白备用。按照说明书制备浓缩胶10 ml，分离胶20 ml。上样后电泳分离，转PVDF膜后孵育一抗，在4 ℃冰箱避光孵育过夜(>12 h)。Survivin一抗(ab76424, Abcom公司，中国)经一抗稀释液1︰10 000稀释后加入样本离子膜。第2天用PBST稀释液洗膜，重复3次，加用山羊抗小鼠IgG二抗(P-2771MP, ThermoFisher,中国)经二抗稀释液1︰1 000稀释后孵育二抗1.5 h，用PBST稀释液洗膜，重复3次，而后用DAB显影液处理样本。Image J软件分析蛋白条带。

4. Transwell小室实验检测细胞的迁移: 将空白对照组，空白病毒载体组，shRNA干扰 Survivin载体病毒组等细胞经胰蛋白酶消化后收集，按照试剂盒(康宁Transwell小室3402，Costar)的说明书，将基底膜的基质原液放在冷藏冰箱(4 ℃)过夜融化，然后与预冷的无血清的RPMI-1640按照1︰3的比例配置侵袭上室凝胶液体，以每孔55 μl的量包被Transwell小室的上室，放置在37 ℃的孵育箱，2 h后使上室成胶。然后上室每孔接种200 μl不含血清的细胞培养液，下室加入10%胎牛血清的RPMI-1640培养液500 μl。然后将Transwell板放置在37 ℃的孵育箱中培养24 h后用结晶紫染色。然后将Transwell板用倒置光学显微镜，拍照，并且进行细胞计数。所有实验均重复3次。

5. CCK-8实验检测细胞的增殖: 将空白对照组，空白病毒载体组，shRNA干扰 Survivin载体病毒组等细胞经胰蛋白酶消化后收集，按照CCK-8试剂盒(CA1210,索莱宝，中国)的说明书，将3组转染后的细胞接种在96孔板中，转染细胞以每孔5 000个/100 μl的接种量接种，72 h后每孔加入10 μl的CCK-8的试剂，放到37 ℃的孵育箱中培养2 h。然后用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度，每组设置3个复孔。

6. AV-PI双染检测细胞的凋亡: 将空白对照组，空白病毒载体组，shRNA干扰 Survivin载体病毒组等细胞经胰蛋白酶消化后收集，按照AV-PI的试剂盒的说明书(4830-01-1，深圳纽邦，中国)检测3组细胞的凋亡率。流式细胞仪分析各组样本，计算各组的凋亡率,凋亡率的计算=(早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数)/细胞总数。Annexin V+/PI-为早期凋亡细胞，Annexin V+/PI+为晚期凋亡和坏死细胞，Annexin V-/PI-为具有正常活性的细胞。

四、统计学方法

结 果

一、shRNA干扰 Survivin病毒载体的构建和转染

慢病毒转染效率，见图1。慢病毒滴度的检测结果：shRNA干扰 Survivin病毒组的慢病毒的滴度为1×108TU/ml，这说明慢病毒转染细胞具有较高的转染效率。

图1 shRNA干扰 Survivin载体病毒载体的转染；注：用0.11 μl和0.033 μl慢病毒转染肺癌细胞系A549细胞，慢病毒滴度的检测结果：shRNA干扰 Survivin载体病毒组慢病毒的滴度为1×108 TU/ml

二、Transwell实验检测细胞的迁移

Transwell实验结果显示，空白对照组中透过分子筛的细胞数为(131.32±18.39，n=3)，空白载体病毒对照组中透过分子筛的细胞数为(142.11±14.02，n=3)，shRNA干扰 Survivin载体病毒组中透过分子筛的细胞数为(52.11±4.09，n=3)。三组之间比较具有明显的统计学差异(F=31.982，P<0.05)。其中shRNA干扰 Survivin载体病毒组和空白载体病毒组相比，具有明显的统计学差异(P<0.05)说明shRNA干扰 Survivin载体病毒组细胞的迁移比空白载体病毒组细胞数少，见图2。

图2 Transwell实验检测细胞的迁移检测结果；注：A：空白对照组；B：空白载体病毒对照组；C：shRNA Survivin慢病毒载体组

三、CCK-8检测细胞的增殖

CCK-8检测结果显示，空白对照组细胞的增殖率(%)为(60.34±1.24，n=3)，空白载体病毒对照组的增殖率(%)为(51.12±2.47，n=3)，shRNA干扰 Survivin载体病毒组的增殖率(%)为(24.27±3.11，n=3)，三组比较有明显的统计学差异(P<0.05)。shRNA干扰 Survivin载体病毒组与空白载体病毒对照组比较具有明显的统计学差异(P<0.05)提示shRNA干扰 Survivin载体病毒组细胞的增殖率比空白载体病毒对照组低，见图3。

图3 CCK-8检测细胞的增殖(×100)

四、AV-PI检测细胞的凋亡

AV-PI检测结果显示，空白对照组细胞的凋亡率(%)为(4.21±1.24，n=3)，空白载体病毒对照组的凋亡率(%)为(3.09±1.13，n=3)，shRNA干扰 Survivin载体病毒组的凋亡率(%)为(35.21±13.31，n=3)，三组比较具有明显的统计学差异(P<0.05)。shRNA干扰 Survivin载体病毒组与空白载体病毒对照组比较具有明显的统计学差异(P<0.05)。说明shRNA干扰 Survivin载体病毒组细胞的凋亡率比空白载体病毒对照组要高，见图4。

五、RT-qPCR和Western-Blot检测各组的凋亡基因Caspase-3,Caspase-9的表达

shRNA干扰 Survivin载体病毒组与空白载体病毒组相比，具有统计学差异(t=2.097，P=0.0219<0.05)。从mRNA水平上说明shRNA干扰 Survivin载体病毒组中Caspase-3与空白载体病毒组相比，表达量降低，表明shRNA干扰 Survivin可以有效抑制凋亡蛋白Caspase-3的表达，从而可以抑制凋亡。shRNA干扰 Survivin载体病毒组与空白载体病毒组相比，具有统计学差异(P<0.05)。shRNA干扰 Survivin载体病毒组中Caspase-9与空白载体病毒组相比，前者表达量降低，表明shRNA干扰 Survivin可以有效抑制凋亡蛋白Caspase-9的表达，从而可以抑制凋亡。Western-Blot检测结果显示，shRNA干扰 Survivin载体病毒组与空白载体病毒组相比，具有统计学差异(P<0.05)。shRNA干扰 Survivin载体病毒组中Caspase-3与空白载体病毒组相比，表达量降低，表明shRNA干扰 Survivin可以有效抑制凋亡蛋白Caspase-3的表达，从而可以抑制凋亡。shRNA干扰 Survivin载体病毒组与空白载体病毒组相比，shRNA干扰 Survivin载体病毒组中Caspase-9表达量降低(P<0.05)，表明shRNA干扰 Survivin可以有效抑制凋亡蛋白Caspase-9的表达，从而可以抑制凋亡，见图5。

讨 论

shRNA技术相较于siRNA技术具有明显的优势，具体优势在于shRNA技术可以稳定的表达于细胞体系中，并且不会随着细胞的不断传代，表达效价随之降低[7]。shRNA技术可以更好的针对基因进行沉默，可以使基因获得更加稳定。鉴于以上优点。shRNA技术越来越引起大家的注意，为临床上进行基因治疗提供了新的研究方法。唐益庭等[8]用shRNA下调泛素表达，探究shRNA对肺癌细胞的作用，发现shRNA可以抑制人肺癌H1299细胞生长并促进其凋亡。本研究采用shRNA技术，构建shRNA干扰 Survivin病毒载体，从基因水平将Survivin基因沉默，抑制Survivin基因的表达，观察了Survivin基因沉默后的肿瘤细胞的凋亡，迁移和增殖的水平。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，Survivin具有肿瘤特异性，只表达于肿瘤和胚胎组织[9-10]。‘梦泽等[11]采用survivin基因表达对肿瘤细胞A549和Hela S3细胞的影响进行探讨，发现siRNA能有效沉默survivin基因在多种肿瘤细胞中的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖。本研究探讨shRNA-Survivin基因对肺癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响，旨在寻求新的基因治疗方法，为临床上肺癌的治疗提供新的思路。

图4 AV-PI检测细胞的凋亡；注：A：空白对照组的凋亡检测；B：空白载体病毒组的凋亡检测；C：shRNA干扰 Survivin载体病毒组的凋亡检测；D： 三组凋亡的检测结果分析

图5 RT-qPCR和Western-Blot检测空白对照组，空白载体病毒组和shRNA干扰 Survivin载体病毒组的凋亡基因Caspase-3,Caspase-9的表达水平；注：A：Caspase-3基因的mRNA表达水平；B：Caspase-9基因的mRNA表达水平；C：Western-Blot检测结果；D：Western-Blot检测结果的蛋白相对表达量的结果分析

Caspase家族是近年来细胞凋亡领域中分子生物学研究的重要发现之一，在凋亡的最后阶段是通过Caspase家族的激活和表达而实现的。其中Caspase-3和Caspase-9是Caspase家族中与凋亡密切相关的蛋白酶[12-13]。郭晓东等[14]的研究表明Caspase-9蛋白酶与肝癌细胞的凋亡有密切联系。本研究将Caspase-3和Caspase-9作为肺癌细胞凋亡的标志蛋白，研究在shRNA作用下，其对肺癌细胞凋亡的影响。通过RT-qPCR方法检测shRNA-Survivin对肺癌细胞中凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平表达的影响。结果显示，shRNA-Survivin载体病毒组与空白载体病毒组相比，前者可以明显提高肺癌细胞的凋亡率，由此可见shRNA-Survivin在肺癌细胞的凋亡中具有明显的作用。另外通过蛋白水平Western-Blot检查结果也表明了此种趋势，进一步证实了shRNA干扰 Survivin载体在肺癌细胞的凋亡中具有明显促进作用。

王俊钢等[15-18]研究证实了非小细胞肺癌的迁移与小RNA有关，本研究进一步利用Transwell的实验方法检测shRNA干扰 Survivin对肺癌细胞的迁移的作用。发现shRNA干扰 Survivin对肺癌细胞的迁移具有明显的抑制作用。另外，本研究还利用CCK-8实验方法检测了肺癌肿瘤细胞的增殖，发现shRNA干扰 Survivin对肺癌细胞的增殖具有明显抑制作用。本研究利用AV-PI凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡，结果表明shRNA干扰 Survivin对肺癌细胞的过度凋亡也具有明显增强作用。

然而本文结果，只是初步探讨了shRNA干扰Survivin对肺癌细胞的作用，发现其可以有效的抑制肺癌细胞的迁移和增殖，并且提高其凋亡率，但是对其具体起作用的分子生物学机制并不完全明了，尚需进一步的研究。shRNA干扰 Survivin可以有效的抑制肺癌细胞的迁移和增殖，并且提高其凋亡率，为临床上肺癌的预防与治疗提供了新的思路与方法。