白念珠菌磷脂甘露聚糖对单核细胞产生白介素-6、白介素-8的影响

陈 青，李 岷，唐荣才，刘维达，周武庆，沈永年，吕桂霞

1江苏省血液中心，南京210042

2中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所真菌科，南京210042

近年来，各种因素造成的免疫缺陷患者数量剧增，使得深部真菌感染发病率逐年上升。据报道在美国超过72%的院内真菌感染为念珠菌所致，白念珠菌是最常见的致病念珠菌［1］。Toll样受体 (Tolllike receptor，TLR)作为一类重要的模式识别受体通过识别白念珠菌细胞壁中的多糖成分激活宿主免疫反应［2］。单核巨噬细胞为天然免疫中重要反应细胞，其表面可表达包括TLR在内的多种模式识别受体。本研究旨在探讨白念珠菌胞壁磷脂甘露聚糖(phospholipomannan，PLM)能否依赖TLR2诱导人急性单核细胞白血病细胞系细胞 (THP-1)产生的炎症反应。

材料和方法

细胞、菌株、主要试剂白念珠菌 (ATCC32354)和人THP-1细胞株购自美国 (American Type Culture Collection，ATCC)，肽聚糖 (peptidoglycans，PGN)、脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)为 Sigma公司产品，小鼠抗人TLR2抗体单克隆抗体 (sc52909)为Santa Cruz公司产品，白介素 (interleukin)-6、IL-8酶联免疫吸附试剂盒购自R＆D Systems公司，Super-ScriptⅢ逆转录酶试剂盒为美国Invitrogen公司产品，中和抗体抗人TLR2抗体TL2.1和抗人TLR4抗体HTA125为eBioscience公司产品。

细胞培养人THP-1单核细胞用含10%小牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养基，于37℃、5%CO2湿度环境下培养、传代。接种2×106细胞于6孔培养板，血清饥饿16 h后，予不同刺激物共培养。

实时荧光定量逆转录PCR终浓度分别为PLM(50 μg/ml)、TLR2 配体 PGN(10 μg/ml)、TLR4 配体LPS(1 μg/ml)及PLM水解产物 (HydroPLM)与THP-1细胞共孵育，并设培养基空白对照组。TRIzol法抽提总RNA，按SuperScriptⅢ逆转录酶试剂盒说明书将 2 μg总 RNA合成为 cDNA。使用 Cepheid Smart Cycler System Real-time PCR仪，采用 Syber green法对目的基因进行扩增，相关基因引物和反应条件见文献 ［3］。采用 2-ΔΔCT法对目的基因的变化水平进行计算，ΔCT=目的基因—内参照 (GAPDH);某一样品的ΔΔCT=某一样品的ΔCT—最低表达的样品的 ΔCT。在刺激后 1、6、24 h分别检测 TLR2、TLR4的mRNA水平;刺激后1、4、6 h分别检测IL-6、IL-8的mRNA水平。

酶联免疫吸附法PLM(50 μg/ml)刺激THP-1细胞后8 h;THP-1细胞先予抗人TLR2(TL2.1)、抗人TLR4(HTA125)中和抗体 (终浓度均为10 μg/ml)处理1 h，再予PLM(50 μg/ml)刺激;收集上清液后按照试剂盒说明书检测上清液中IL-6、IL-8的含量。

Western blot分析收集终浓度分别为PLM(50 μg/ml)、TLR2 配体 PGN(10 μg/ml)及 PLM 水解产物 (HydroPLM)作用的THP-1细胞，裂解细胞、提取总蛋白。等量蛋白的不同样品梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转至聚偏二氟乙烯膜上。封闭液作用2 h，小鼠抗人TLR2抗体单克隆抗体4℃孵育过夜。TBS液洗膜3次后，辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG第二抗体反应2 h，TBS液洗膜3次，Supersignal试剂显色发光，暗室胶片曝光。检测TLR2的蛋白表达。

统计学处理采用Excel进行统计分析。计量数据以±s表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

PLM对TLR2、TLR4表达的影响刺激后1 h PLM组、PGN组、水解PLM组和对照组的TLR2表达分别为3.1251±0.1877、2.7649±0.2519、1.5951±0.1896和1.5092±0.3184，PLM组、PGN组均显著高于对照组和水解PLM组 (P=0.0002，P=0.0010;P=0.0040，P=0.0001);刺激后6 h各组TLR2表达分别为 5.5679±0.7660、6.1660±0.6234、1.5984±0.4905和1.4560±0.1960，PLM组、PGN组均显著高于对照组和水解PLM组 (P=0.0000，P=0.0000;P=0.0003，P=0.0003);刺激后24 h各组TLR2表达分别为4.1262±0.8495、5.2348±0.5356、1.5239±0.1949和 1.5053±0.3305，PLM组、PGN组均显著高于对照组和水解PLM组 (P=0.0002，P=0.0000;P=0.0007，P=0.0010)。刺激后1 h PLM组、LPS组和对照组的TLR4表达分别为1.5375±0.1478、2.7368±0.2700和1.5461±0.3020，LPS组显著高于对照组 (P=0.0002);刺激后6 h各组 TLR4表达分别为1.6162±0.2199、5.5132±0.2486和1.5844±0.1730，LPS组显著高于对照组 (P=0.0000);刺激后24 h各组TLR4表达分别为1.6067±0.0557、4.2277±0.2149和1.5573±0.1335，LPS组显著高于对照组 (P=0.0000)。

THP-1细胞与PLM、PGN和水解PLM共孵育1 h，Western blot检测 TLR2蛋白表达结果显示，PLM、PGN能上调TLR2蛋白表达，而水解PLM、对照组则不能上调 (图1)。

图1 磷脂甘露聚糖、肽聚糖、水解磷脂甘露聚糖对TLR2蛋白表达的影响Fig 1 Effects of phospholipomannan，peptidoglycans，and hydrophospholipomannan on the protein expressions of TLR2

PLM对IL-6和IL-8 mRNA表达和分泌的影响刺激后1 h PLM组、PGN组、水解PLM组和对照组的IL-6水平分别为16.3355±4.7438、11.5578±3.4565、1.9678±0.2761和 1.2543±0.2075，PLM组、PGN组均显著高于对照组和水解PLM组 (P=0.0005，P=0.0008;P=0.0009，P=0.0010); 刺激后4 h各组 IL-6水平分别为27.9094±2.7474、34.8171±3.6132、2.4026±0.5491和1.3349±0.1178，PLM组、PGN组均显著高于对照组和水解PLM组 (P=0.0000，P=0.0000;P=0.0000，P=0.0001);刺激后6 h各组IL-6水平分别为14.3353±2.9305、19.0375±3.4083、1.8760±0.2265和1.2297±0.2399，PLM组、PGN组均显著高于对照组和水解 PLM组 (P=0.0004，P=0.0003;P=0.0002，P=0.0004)。刺激后1 h PLM组、PGN组、水解PLM组和对照组的IL-8水平分别为17.0889±3.3981、13.0276±1.7247、2.0700±0.3191和1.3313±0.2118，PLM组、PGN组均显著高于对照组和水解 PLM组 (P=0.0001，P=0.0001;P=0.0000，P=0.0001);刺激后4 h各组IL-8水平分别为 44.1305±4.0953、47.1630±8.6333、1.9291±0.3473和1.1815±0.2067，PLM组、PGN组均显著高于对照组和水解PLM组 (P=0.0000，P=0.0000;P=0.0000，P=0.0000);刺激后6 h各组IL-8水平分别为 24.4385±5.0250、32.0647±5.0091、1.9850±0.2946和1.4366±0.2953，PLM组、PGN组均显著高于对照组和水解PLM组 (P=0.0000，P=0.0000;P=0.0001，P=0.0001)。

PLM组上清液中IL-6含量(641.2175±122.6536)pg/ml显著高于对照组的 (46.9180±3.3621)pg/ml(P=0.0001)，IL-8含量(861.3872±52.4685)pg/ml显著高于对照组的 (69.3642±9.1684)pg/ml(P=0.0001)。

TLR2、TLR4中和抗体对PLM诱导IL-6和IL-8产生的影响PLM组、抗TLR2组、抗TLR4组和空白对照组IL-6的含量分别为 (578.0129±29.4468)、(182.3973±24.3148)、 (552.7812±30.4400)和 (13.7383±2.8435)pg/ml，抗TLR2组显著低于 PLM组 (P=0.0003)。PLM组、抗TLR2组、抗TLR4组和空白对照组IL-8的含量分别为 (866.1743±8.9108)、 (269.6849±25.7352)、(771.0063±9.9199)和 (26.4169±8.8615)pg/ml，抗TLR2组显著低于PLM组 (P=0.0010)。

讨 论

模式识别受体识别病原微生物上的保守结构分子即病原体相关分子模式激活宿主抗病原体的免疫反应。白念珠菌的病原体相关分子模式主要为胞壁多糖，包括β-葡聚糖、甘露聚糖、几丁质等。甘露聚糖与蛋白质或脂类共价结合，存在于胞壁最外层，由β-1，2连接的甘露糖残基构成的多糖部分与磷脂连接形成磷脂甘露聚糖。识别白念珠菌的模式识别受体主要包括TLR和C-型凝集素受体两类，TLR2、TLR4在机体抗白念珠菌感染中发挥重要作用［2］。

有研究显示PLM体外能诱导人THP-1单核巨噬细胞系和小鼠巨噬细胞分泌TNFα［4］。本研究表明PLM能在mRNA和蛋白水平诱导THP-1细胞产生IL-6、IL-8，PLM及TLR2受体的激动剂PGN体外均上调TLR2 mRNA表达的水平，且呈时间-效应关系，PLM还能在蛋白水平诱导TLR2的表达，而PLM未能诱导TLR4的mRNA表达。此外，TLR2中和抗体能显著抑制PLM诱导THP-1细胞的IL-6、IL-8分泌，而TLR4中和抗体则不能抑制。提示PLM只通过与TLR2相互作用从而诱导 IL-6、IL-8的分泌，而TLR4则不参与此过程。本研究结果与Jouault等［5］报道的结果略有差异，Jouault等［5］发现 PLM诱导的TLR4敲除小鼠巨噬细胞TNFα分泌也有所抑制。差异原因可能与实验所用细胞不同 (本研究采用人的细胞，而Jouault等［5］则是分离小鼠细胞)、所检测的因子不同 (本研究检测的是 IL-6、IL-8，Jouault等［5］检测的是 TNFα)有关。

本研究显示PLM经β-D-甘露糖苷水解酶处理后的产物均不能诱导TLR2及IL-6、IL-8等的表达，表明PLM的上述活性与其β-D-甘露聚糖结构的完整性密切相关，当PLM的β-D-甘露聚糖结构破坏后相关活性即丧失。

［1］Wisplinghoff H，Bischoff T，Tallent SM，et al.Nosocomial bloodstream infections in US hospitals:analysis of 24 179 cases from a prospective nationwide surveillance study ［J］.Clin Infect Dis，2004，39(3):309-317.

［2］Netea MG，Brown GD，Kullberg BJ，et al.An integrated model of the recognition of Candida albicans by the innate immune system［J］.Nat Rev Microbiol，2008，6(1):67-78.

［3］Li M，Chen Q，Shen YN，et al.Candida albicans phospholipomannan triggers inflammatory responses of human keratinocytes through Toll-like receptor 2 ［J］.Exp Dermatol，2009，18(7):603-610.

［4］Jouault T，Bernigaud A，Lepage G，et al.The Candida albicans phospholipomannan induces in vitro production of tumour necrosis factor-alpha from human and murine macrophages［J］.Immunology，1994，83(2):268-273.

［5］Jouault T，Ibata-Ombetta S，Takeuchi O，et al.Candida albicans phospholipomannan is sensed through Toll-like receptors［J］.J Infect Dis，2003，188(1):165-172.