局部冷热交替损伤建立鸸鹋股骨头坏死塌陷模型

2011-11-16汪爱媛孙建奇许文静卢世璧

中国医学科学院学报 2011年4期

范猛，汪爱媛，王玉，彭江，赵斌，刘斌，张莉，孙建奇，许文静，卢世璧

1天津市第一中心医院骨科，天津300192

2中国人民解放军总医院骨科研究所，北京100853

3上海交通大学MED-X研究院生物医学工程系，上海200023

股骨头缺血性坏死多见于30～40岁的青壮年，发病率逐年升高［1］，其中多数患者都将进展为股骨头塌陷，需进行人工关节置换手术。人工关节置换手术早期疗效可靠，但远期仍有松动等情况，需要进行翻修手术［2］。目前有多种保头治疗，包括:电磁刺激、近端旋转截骨、髓心减压和骨移植等，均有一定疗效，但多数患者的病情仍会进展至股骨头塌陷［3］。目前该病治疗手段的进展缓慢，与缺乏一种能够真实模拟人类股骨头缺血性坏死全病程的骨坏死动物模型有一定关系［4］。近年来，鸸鹋作为一种双足负重，身高、体重及股骨头受力情况均与人类类似的动物，通过冷冻方法已经实现股骨头的塌陷而受到关注。Conzemius等［4］采用直接向股骨头打隧道后液氮喷射直接冷冻的方式进行造模，但周围组织损伤明显，坏死范围各异且通常较大，坏死区位置控制不良，不同动物的一致性较差。由于坏死区范围及位置直接影响到股骨头是否塌陷，所以Reed等［3］对其进行改进，采用临床用于肿瘤冷冻治疗的闭合回路冷冻探针进行冷冻造模，可使坏死区较为一致，但未见股骨头塌陷。本研究采用上海交通大学Med-X学院研制的冷热交替治疗系统，定制了探针进行对于鸸鹋股骨头缺血性坏死造模的研究，以期建立较高塌陷率和良好一致性的股骨头缺血坏死全病程动物模型。

材料和方法

实验动物与仪器健康成年雄性鸸鹋20只，月龄＞12个月，体重 (50.0±4.6)kg，由中国人民解放军总医院动物实验中心提供。交替冷热系统为上海交通大学MED-X学院自主研发，由液氮存储及输送系统、射频发生系统、控制系统和温度采集系统组成。其中，针式冷热交替治疗头专为本研究定制，在使用闭合回路液氮冷冻头基础上，同时具有射频发生装置，以实现冷热交替，有效段长度为30 mm，直径2.5 mm;后段为真空保护段，直径5 mm(图1)。使用仪器为美国 GE eXplore Locus小动物活体Micro-CT，最大分辨率27 μm，图像后处理软件为GE公司提供的GE Micro View。亚纳米级硫酸钡由上海安亿纳米科技公司提供，颗粒直径＜500 nm。使用明胶为sigma公司生产，型号G1890。

图1 冷热交替系统Fig 1 Sketch of the alternating freezing and heating system

造模方法及围手术期管理术前12 h禁食水，术前30 min硫酸阿托品1 mg肌肉注射。给予30 mg/kg盐酸氯胺酮及10 mg/kg盐酸噻拉嗪肌肉注射诱导麻醉，盐酸氯胺酮6 mg/(kg·min)静脉点滴维持麻醉，青霉素80万U肌肉注射预防感染。麻醉满意后右髋部脱毛，备皮，碘伏消毒皮肤，铺无菌巾单，以大转子处为中心，取右髋部外侧切口，长约10 cm，分离皮下组织，钝性沿肌纤维方向分离臀大肌，显露大转子后在导航装置引导下向股骨头顶端钻孔到关节软骨下骨，插入上海交通大学研发的闭合回路系统针式冷热交替治疗头，进行液氮冷冻并射频加热交替损伤造模。冷冻3个循环，每个循环9 min，冷冻后使用射频进行主动融化及加热治疗，局部温度监测不高于50摄氏度，并通氮气保护以避免局部过热。冷热交替损伤结束后取出治疗头，生理盐水冲洗创面，分层关闭伤口。术后麻醉苏醒后正常饮食。

术后处理术后未见感染迹象及异常死亡。术后每天观察日常饮食及步态。术后2、4、8、12、16周进行髋关节MRI检查。检查前采用30 mg/kg盐酸氯胺酮及10 mg/kg盐酸噻拉嗪肌肉注射麻醉后固定于定制检查支具，右侧卧位，使用西门子1.0T核磁共振系统进行髋关节冠状位扫描，序列包括T1、T2、TRIM。于术后12周，随机选取3只鸸鹋过量麻醉处死，余17只于术后16周处死。处死前动物于麻醉成功并置换下肢血液后，自腹主动脉注入亚纳米级硫酸钡明胶混悬液，进行下肢血管造影。取出双侧股骨标本，将标本于4%甲醛溶液中固定1周后，行X线检查，并将股骨近端Micro-CT扫描，扫描分辨率为46 μm，单次扫描时间18 min。25%甲酸脱钙后股骨头冠状位切片行常规HE染色。

Micro-CT图像处理对Micro-CT扫描结果用标准体模校准后，将原始图像重建为扫描精度为46 μm的高分辨率图像。通过GE Microview软件进行图像后处理。通过图像的最大密度投影 (maximum intensity projection，MIP)获得二维层面的整体血管分布信息。通过GE Microview软件以等值面重建方法重建三维血管造影图像。以健侧为对照侧，计算股骨头内血管体积占股骨头体积的比率 (血管体积比率);以健侧股骨头体积减去塌陷侧股骨头体积得出塌陷体积，计算塌陷体积占股骨头体积的比率 (塌陷体积比率);计算股骨头内的骨小梁厚度、骨体积分数和骨矿物量。

统计学处理采用SPSS 11.0统计软件，塌陷侧和对照侧血管体积比率、骨小梁厚度、骨体积分数和骨矿物量间的比较采用t检验，塌陷体积比率12周组与16周组间的比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

步态观察鸸鹋于术后6周开始出现跛行，早期仅于奔跑及劳累状态下出现跛行，显示为术侧下肢负重时间变短;出现跛行后1～2周表现为明显跛行，正常行走下就可见跛行步态，显示为术侧下肢负重时间的明显变短，于奔跑时会出现对照侧单足跳动;跛行严重者每日以卧位为主。

标本大体观察可见针式治疗头的针道已被填充。塌陷早期标本表现为股骨头高度减低，软骨面未见明显改变 (图2)。晚期塌陷标本出现股骨头明显的变形，并合并明显软骨退变，与人类股骨头塌陷晚期表现类似。

X线检查X线检查结果显示，股骨头坏死塌陷动物手术侧股骨头高度变低，透光度不均，在关节面下方骨小梁结构紊乱，透光度增加 (图3)。

MRI检查结果鸸鹋冷热交替损伤造模4周内可见股骨广泛水肿表现，水肿信号累及股骨头、干，甚至股骨髁部;至8周后水肿基本局限于股骨头，开始出现股骨头内混杂信号，并可有类似双线征表现;至12、16周可见明显股骨头形态改变及关节间隙改变。2号鸸鹋于塌陷后同时显示出髋臼信号改变及髋关节的半脱位 (图4)。不同动物间影响变化过程类似，病灶范围略有差异。

图3 股骨头塌陷标本术后16周X线检查结果，右侧为手术侧，可见手术侧高度较健侧低，透光度改变Fig 3 X-ray image of femora whose head was collapsed at the 16thweek，right side is the collapsed side，whose height was lower and the transmittance of light was also changed

图4 鸸鹋术后MRI表现，箭头所示方向为股骨头Fig 4 T1-weighted and T2-weighted coronal MRI of representative femora，the femoral heads were pointed with arrows

Micro-CT检查与对照侧比较，可见塌陷侧股骨头骨小梁厚度及密度改变，塌陷侧股骨头内骨小梁厚度不均，排列紊乱，并可见多处骨小梁骨折，股骨头高度变低，股骨头内骨密度分布不均 (图5)。塌陷侧股骨头的骨矿物量和骨小梁间距分别为(380.31±28.12)mg/cm3和(0.86±0.32)mm，明显低于对照侧的 (415.75±41.28)mg/cm3和(1.17±0.17)mm(P均＜0.05);骨体积分数和骨小梁厚度分别为 (47.28±17.14)%和 (506.17±220.58)μm，明显高于对照侧的 (30.92±4.01)%和 (325.50±44.53)μm(P均＜0.05)。

股骨头骨内微血管造影通过MIP获得的血管二维投影和isosurface获得的三维重建影像进行血管结构的双侧比较，结果显示塌陷侧骨内血管数量减少，尤其微小血管减少明显，血管走形迂曲 (图6)。对照侧血管体积分数为 (0.315±0.055)%，明显大于塌陷侧的 (0.142±0.059)% (P＜0.05)。

组织学检查对照侧股骨头显示骨陷窝内骨细胞填充，骨髓内大量细胞存在;塌陷侧股骨头可见大量的空骨陷窝，骨髓出现纤维化，骨小梁边缘形态不规则，部分部位有骨细胞存在，并存在纤维组织填充 (图7)。

讨论

图6 术后16周骨内微血管造影图像Fig 6 Microangiography of emu femoral head at the 16thweek

本研究采用冷热交替的方法建立了鸸鹋的股骨头缺血性坏死塌陷模型，通过连续性的影像学观察可以发现，本研究建立的模型与人类的病程类似，可以从股骨头坏死的早期表现进展到出现髋关节炎性改变甚至髋关节半脱位的晚期表现;并且髋关节周围组织信号改变不明显，显示良好保留了骨坏死的修复能力;病灶为局灶性，与人类易出现股骨头塌陷的病理表现类似的位于软骨下方，关节负重区。Micro-CT和组织学检查显示股骨头内血运受损，骨小梁骨折，空骨陷窝等与人类股骨头坏死类似的改变。冷热交替损伤可以造成骨细胞和骨内血管的损伤而造成股骨头坏死，而破坏性骨修复可能是造成股骨头塌陷的机制。

鸸鹋并不是标准的实验动物，本研究之所以选择鸸鹋，一方面是因为鸸鹋与人类类似的双足负重，而且成年鸸鹋身高约1.8m，体重约50kg，与成人身高体重接近。更重要的股骨头的应力分布数据与人类髋关节的测量数据类似，不但应力大小接近，应力方式也类似［5］。Goetz等［6］测量发现，鸸鹋股骨头的负重集中于顶端，且受力为沿股骨干的方向，均与人类相似，所测量两只鸸鹋股骨头负重最大约5.5倍体重，略大于以往报道的人类的约4倍体重。

破坏性骨修复造成了骨结构的破坏而产生了与人类类似的股骨头塌陷表现，这种修复方式在四足动物的骨坏死研究中也有报道［7-8］，但是并没有造成股骨头的塌陷。由于股骨头的力学负荷也是产生股骨头塌陷的原因［9］，两足动物和四足动物的髋关节生物力学的差异可能就是造成不同股骨头是否塌陷的关键性因素。

低温手术已经应用于临床，它指利用液氮或液氦等制冷物质在特殊装置的控制下，杀伤特定区域内的细胞 (如肿瘤细胞)，达到治疗作用。通常包含迅速制冷、缓慢复温及反复冻融3个过程。低温手术的损伤机制包括对细胞的直接杀伤作用和造成血管内皮受损、血管阻塞，最终引起局部组织缺血死亡［10-11］。这与股骨头缺血坏死的机制类似，所以可以使用冷冻方法进行股骨头缺血坏死的造模。早期Conzemius等［4］采用直接股骨头打隧道后喷射液氮直接冷冻的方式进行造模，但这种方法难以控制液氮的流量以及液气相变［12］，操作中会造成周围组织的损伤，存在坏死范围各异且通常较大，坏死区位置控制不良，不同动物的一致性较差，且周围组织受损伤明显，不同于人类股骨头缺血性坏死的病理表现［3］。由于坏死区的范围及位置直接影响到股骨头是否塌陷，Reed等［3］对其进行改进，改为使用临床用于肿瘤冷冻治疗的闭合回路的冷冻治疗头进行冷冻造模，易于控制手术冷冻范围及位置，而且通过隔热装置很好的避免了对周围组织的副损伤，从而可以产生坏死区较为一致，周围组织无损伤的更接近人类股骨头缺血坏死病理表现的动物模型。而在肿瘤的热物理治疗中，已经从单纯的冷冻治疗发展到冷热交替治疗。本研究采用上海交通大学MED-X学院研制的冷热交替治疗系统，这套装置采用冷热交替治疗，可以弥补单冷及单热治疗的局限性，在软组织肿瘤治疗实验中已经证实优于单纯的冷冻治疗［13］。其中冷冻部分与 Conzemius等［4］及 Reed 等［3］使用的类似，均为闭合回路的液氮冷冻系统，且冷冻头设计也很相近;热疗部分采用射频加热的方法。射频治疗本身也已经证实可以杀伤细胞造成骨坏死［14-16］。冷热交替治疗，在加强单冷及单热治疗效果的基础上，还可以加快冷冻后的融解过程，缩短手术时间。沈圆圆等［17］研究发现，冷热交替治疗下治疗范围内的组织承受更大更快的温度变化，对局部的细胞和血管产生更大的热应力，造成更严重的损伤。

由于股骨头的塌陷与股骨头内骨坏死区的位置和大小有关，本研究采用程序控制的冷热交替系统来控制损伤的程度，并使用导向装置控制损伤的位置，造成鸸鹋股骨头内比较一致的坏死区。为了更好的比较冷热交替与单纯冷冻损伤在造成骨坏死程度上的不同，在冷冻过程中，本研究采用了与Reed等［3］使用的单纯闭合回路液氮冷冻进行骨坏死造模相同的冷冻过程，由于Reed等［3］的造模并无塌陷报道，故笔者认为在造成骨坏死方面使用冷热交替的方式优于使用单纯冷冻的方式，冷热交替系统在骨肿瘤微创治疗方面也将具有很好的前景。

综上，本研究采用冷热交替法建立鸸鹋股骨头缺血坏死模型，可以实现在周围组织无明显损伤情况下，以较高的塌陷率和一致性建立股骨头缺血坏死从早期至晚期的全程模型。本模型可以用于研究骨坏死的塌陷机制，修复机制;尤其是对于股骨头坏死治疗以及预防方法的比较和验证建立了良好的平台。

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