抗人球蛋白检测卡行业标准的研究

胡泽斌，孙彬裕，孙晶，王布强，于婷

·技术与方法·

抗人球蛋白检测卡行业标准的研究

胡泽斌，孙彬裕，孙晶，王布强，于婷

100050 北京，中国食品药品检定研究院体外诊断试剂检定所（胡泽斌、孙彬裕、孙晶、于婷）；214400 江阴，江苏力博医药生物技术股份有限公司（王布强）

抗人球蛋白试验已成为临床上保障安全输血，诊断预防新生儿溶血病、自身免疫溶血性疾病、药物免疫溶血性疾病以及血型学研究工作中最重要的实验技术[1-3]。抗人球蛋白检测试剂以凝胶柱或玻璃珠柱的柱凝集法为主流，是一个量大面广的产品[4-5]。从监管角度，属于 III 类高风险体外诊断试剂产品。随着检测技术发展和临床需要的增加，国内外已有多家生产企业开发的抗人球蛋白检测卡获得国家药监局批准，并且仍有不少企业正在申报该类产品的注册。但是该类试剂没有相应的国家标准或行业标准，对产品临床使用上的风险不易把控。因此急需制订针对抗人球蛋白检测卡的行业产品标准来规范统一此类产品的技术评价指标，并对此类试剂质量进行评估。

按照国家药品监督管理局 2020 年医疗器械行业标准制修订计划，由中国食品药品检定研究院牵头，组织多家行业内的检测机构以及生产企业，起草制订了《抗人球蛋白检测卡（柱凝集法）》医药行业标准。本研究选取 6 个代表性的国内外生产企业的 42 批次抗人球蛋白检测卡，对拟定标准的技术指标和检验方法进行全面试验验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 抗人球蛋白凝胶卡由上海血液生物医药有限责任公司提供；抗人球蛋白检测卡（微柱凝胶法）、直接抗人球蛋白试剂分类卡（微柱凝胶法）由盖立复医药科技（上海）有限公司提供；低离子抗人球蛋白卡（微柱凝胶法）由伯乐生命医学产品（上海）有限公司提供；抗人球蛋白（抗 IgG + C3d）检测卡（柱凝集法）、抗人球蛋白（抗 IgG）检测卡（柱凝集法）、抗人球蛋白（抗 IgG、抗 C3d）检测卡（柱凝集法）由江苏力博医药生物技术股份有限公司提供。抗人球蛋白（IgG）检测试剂卡（柱凝集法）、抗人球蛋白（IgG，C3b/C3d）检测试剂卡（柱凝集法）由奥森多医疗器械贸易（中国）有限公司提供；抗人球蛋白检测卡及抗人球蛋白检测卡（IgG + C3d）由长春博迅生物技术有限责任公司提供。

1.1.2 标准品 抗人球蛋白试剂（抗 IgG + C3d）国家标准品，批号：370029-201601，0.5 ml/支，绿色冻干品，由中国食品药品检定研究院提供；抗人球蛋白试剂（抗 IgG）国家标准品，批号：370028-201601，0.5 ml/支，白色冻干品，由中国食品药品检定研究院提供。

1.1.3 仪器 北利离心机、恒温水槽、微量移液器由中国食品药品检定研究院提供；试剂卡孵育器（型号：K37-24）和血型卡离心机（型号：TD2-24）由上海血液生物医药有限责任公司提供；医用离心机（型号：DG Spin）和孵育器（型号：DG Therm）由盖立复医药科技（上海）有限公司提供；久保田离心机（型号：KA-2200）、卡式离心机（型号：D-Centrifuge L）和卡式孵育器（型号：ID-Incubator L）由伯乐生命医学产品（上海）有限公司提供；血型及配血离心孵育工作组（型号：ORTHO workstation）、全自动血型及配血分析系统（型号：Ortho Autovue Innova）由奥森多医疗器械贸易（中国）有限公司提供；多管架离心机（型号：TDZ5-WS）、孵育器（型号：FYQ）、离心机（型号：TD-A）由长春博迅生物技术有限责任公司提供；医用离心机（型号：LB-3000）、久保田离心机（型号：KA-2200）、恒温水箱（型号：HH-600）由江苏力博医药生物技术股份有限公司提供。

1.2 方法

对现有抗人球蛋白检测卡产品的性能指标进行调研评估，结合临床实际需求，参考国内外相关技术指标，制订《抗人球蛋白检测卡（柱凝集法）》行业标准，性能指标包含外观、特异性、灵敏度、重复性、批间重复性、稳定性项目，选择 6 家企业的抗人球蛋白检测卡对这些评价指标和检验方法进行全面验证。

1.2.1 外观 在自然光下目视检查产品外观，一般由制造商规定产品的外观要求，通常应有试剂各组分组成、性状；内外包装完整、标签清晰等的要求。

1.2.2 特异性与灵敏度

1.2.2.1 间接抗人球蛋白试验 按照抗人球蛋白检测卡（以下简称检测卡）的产品说明书中间接抗人球蛋白试验的方法进行操作和判断。将 IgG 型抗 D 抗体、抗 Jka/Jkb抗体、抗Fya/Fyb抗体与相应抗原阳性的红细胞在检测卡中反应，37 ℃孵育后离心，目测观察，结果应均为阳性反应，且凝集强度应分别≥ 3+、≥ 1+、≥ 1+；与相应抗原阴性的红细胞在检测卡中反应，结果应均为阴性反应；健康人的血浆或血清与 O 型红细胞在检测卡中反应，结果应为阴性反应。

1.2.2.2 直接抗人球蛋白试验 抗人球蛋白检测卡的 IgG 柱中加入 IgG 型抗 D 抗体、抗 Jka/Jkb抗体、抗 Fya/Fyb抗体致敏的相应抗原阳性红细胞，结果应均为阳性反应，且凝集强度应分别≥ 3+、≥ 1+、≥ 1+；加入同样致敏操作的相应抗原阴性红细胞，结果应均为阴性反应。当此柱仅为抗 IgG 柱时，与 C3d 致敏的红细胞反应，结果应为阴性反应。

抗人球蛋白检测卡的 C3d 柱中加入 C3d 致敏的红细胞，结果应为阳性反应且凝集强度应≥ 1+；当此柱仅为抗 C3d 柱时，与 IgG 型抗 D 抗体致敏的红细胞反应，结果应为阴性反应。

1.2.3 国家标准品的效价比对试验 待检抗人球蛋白（抗 IgG）检测卡和抗人球蛋白（抗IgG、抗 C3d）检测卡使用抗人球蛋白试剂（抗 IgG）国家标准品进行同步比对，待检抗人球蛋白（抗 IgG + C3d）检测卡应使用抗人球蛋白试剂（抗 IgG + C3d）国家标准品进行同步比对。按国家标准品的说明书进行操作和判断，检测卡间接抗人球蛋白试验检测 IgG 型抗 D 抗体的效价，应不低于用相应抗人球蛋白试剂国家标准品同步试管法测得的效价。

1.2.4 批内重复性 间接抗人球蛋白试验：用同批检测卡分别对能产生 1+ ～ 2+ 凝集强度稀释度的 IgG 型抗体与相应抗原阳性和阴性红细胞样本进行检测，各重复检测 10 次，结果均应一致；且阳性结果凝集强度的差异不超过1 个 +。

直接抗人球蛋白试验：用同批检测卡分别对能产生1+ ～ 2+ 凝集强度稀释度的 IgG 型抗体致敏的红细胞进行检测，对同一 C3d 致敏和未致敏红细胞样本进行检测，各重复检测10 次，结果均应一致且阳性结果反应强度的差异不超过 1 个 +。

1.2.5 批间重复性 用 3 个批次的检测卡分别对批内重复性进行检测，比较 3 批检测卡的结果，应符合相应要求。

1.2.6 效期稳定性 制造商应规定过效期后多长时间内进行效期稳定性检测，一般取到效期后一个月内的产品，检验其外观、特异性、灵敏度和批内重复性，结果应符合上述要求。

1.2.7 热稳定性 制造商应规定热稳定性的放置时间是否与剩余效期有关，一般在 37 ℃条件下加热检测卡 7 d 后，检验其外观、特异性、灵敏度和批内重复性，结果应符合上述要求。

2 结果

2.1 外观验证结果

采用 6 家共 42 批次抗人球蛋白检测卡试剂盒，依据拟定抗人球蛋白检测卡行业标准的性能指标进行全部验证，所有试剂盒的各组分齐全、完整，包装标签清晰、无磨损，试剂卡封口完好，凝胶柱形态完整，凝胶呈均匀微颗粒状，无干裂或气泡、异物等。外观均符合行业标准规定。

2.2 特异性与灵敏度验证结果

使用三种检测卡：抗人球蛋白（抗 IgG + C3d）检测卡（柱凝集法）、抗人球蛋白（抗 IgG、抗 C3d）检测卡（微柱凝胶法）、抗人球蛋白（抗 IgG）检测卡（柱凝集法）对标准进行验证。间接抗人球蛋白试验中，将 IgG 型抗 D 抗体、抗 Jka或 Jkb抗体、抗 Fya抗体分别与 D 抗原、Jka或 Jkb抗原、Fya抗原阳性的红细胞在检测卡中进行反应，结果均为阳性反应，凝集强度分别是 3+ ～ 4+、1+ ～ 3+、1+ ～ 4+；与相应抗原阴性的红细胞反应，结果均为阴性反应；将 AB 型血浆与 O 型红细胞在检测卡中进行反应，结果均为阴性反应。间接抗人球蛋白试验的验证结果如表 1 所示，均满足拟定标准的要求。

直接抗人球蛋白试验中，将 IgG 型抗 D 抗体、抗 Jka或 Jkb抗体、抗 Fya抗体致敏的相应抗原阳性红细胞，C3d 致敏的红细胞加入到检测卡中进行反应，结果均为阳性反应，凝集强度分别是 3+ ～ 4+、1+ ～ 4+、1+ ～ 4+、1+ ～ 4+；将同样致敏操作的相应抗原阴性红细胞加入到检测卡中进行反应，结果均呈阴性反应；检测卡的微柱仅为抗 IgG 柱时，与 C3d 致敏的红细胞反应，结果均为阴性反应；检测卡的微柱仅为抗 C3d 柱时，与IgG 型抗 D 抗体致敏的D 抗原阳性红细胞反应，结果均为阴性反应。直接抗人球蛋白试验的验证结果如表2 所示，均满足拟定标准的要求。

表 1 间接抗人球蛋白试验的特异性和灵敏度验证结果

注：“-”表示阴性反应；“/”表示该试剂盒未对该项指标进行验证；试剂盒为抗人球蛋白分型检测卡（抗 IgG、抗 C3d）时，仅抗 IgG 柱进行间接抗人球蛋白试验的验证，抗 C3d 柱不进行间接抗人球蛋白试验的验证。

表 2 直接抗人球蛋白试验的特异性和灵敏度验证结果

注：“-”表示阴性反应；“/”表示该试剂盒未对该项指标进行验证。

2.3 效价比对试验结果

抗人球蛋白试剂（抗 IgG + C3d）国家标准品用于评价不同厂家的柱凝集法的抗人球蛋白卡（抗 IgG + C3d）间接抗人球蛋白试验检测 IgG 型抗体的效价，抗人球蛋白试剂（抗 IgG）国家标准品用于评价不同厂家柱凝集法的抗人球蛋白卡（抗 IgG 部分）间接抗人球蛋白试验检测 IgG 型抗体的效价。结果如表 3 所示，4 家企业的抗人球蛋白卡（抗 IgG + C3d）的效价测定结果在 1:512 ～ 1:1024，3 家企业的抗人球蛋白卡（抗 IgG）的效价测定结果在 1:512 ～ 1:1024，均高于相应国家标准品的同步效价结果，满足要求。

表 3 国家标准品的效价比对试验验证结果

2.4 重复性验证结果

采用表 1 中 6 个企业的 11 种抗人球蛋白检测卡各 3 批次，进行了批内重复性和批间重复性实验验证。间接抗人球蛋白试验的重复性结果显示，1+ ～ 2+ 凝集强度稀释度的 IgG 型抗体与 D 抗原阳性红细胞进行重复检测 10 次，11 种抗人球蛋白检测卡结果均为阳性且凝集强度的差异不超过 1 个 +；1+ ～ 2+ 凝集强度稀释度的 IgG 型抗体与 D 抗原阴性红细胞进行重复检测 10 次，11 种抗人球蛋白检测卡结果均为阴性。

直接抗人球蛋白试验的重复性结果显示，将 1+ ～ 2+ 凝集强度稀释度的 IgG 型抗体致敏的红细胞和 C3d 致敏红细胞进行重复检测 10 次，11 种抗人球蛋白检测卡结果均为阳性且凝集强度的差异不超过 1 个 +。将未致敏红细胞样本进行重复检测 10 次，11 种抗人球蛋白检测卡结果均为阴性。

2.5 稳定性验证结果

效期稳定性和热稳定性项目中，均采用表 3 中 5 家企业的 7 种抗人球蛋白检测卡各 1 批次，对过效期的检测卡和 37 ℃加热 7 d 的检测卡，进行外观、特异性、灵敏度和批内重复性项目的性能检测。试验结果显示，所有项目均符合拟定行业标准的要求。

3 讨论

抗人球蛋白试验（又称 Coombs 试验）是测定结合在红细胞上的抗体和（或）补体的主要方法。直接 Coombs 试验是检测体内已被抗体和（或）补体致敏的红细胞。间接 Coombs 试验通过血清与细胞的孵育，证实抗体和（或）补体与红细胞在体外的结合。在临床常规的交叉配血、抗体筛检鉴定、新生儿溶血病诊断过程中胎（婴）儿致敏红细胞检测、新生儿溶血病胎（婴）儿或母体不完全抗体的检测中，要求对具有输血史、妊娠史以及输用过血液制品的受血者和供血者都应该进行不完全抗体检测[6-8]。最初最广泛使用的 Coombs 试验是使用抗人球蛋白检测液体试剂在试管中进行检测，即试管法，但该方法操作步骤繁琐，且不能同时对多份样本检测。1989 年，法国学者发明了一种凝胶技术，该技术很快商品化并迅速推广应用到临床输血，并产生了“凝胶试验”（gel test）的专用名词[9-12]。不完全抗体和相应抗原红细胞，在含有抗人球蛋白凝胶介质中进行的 Coombs 试验被称为微柱凝胶 Coombs 试验。随着技术研发的不断进步，除凝胶柱之外，还出现了玻璃珠柱的抗人球蛋白检测卡。这种柱凝集法的抗人球蛋白检测卡以其简便快捷和高灵敏度的优势在临床中广为使用，但是不同厂家的产品在原材料的选择和设计、样本的选取及成品质量控制等方面有所差异，导致检测结果的准确性也受到影响。因此制订一个抗人球蛋白检测试剂的通用标准，统一规范及要求，与抗人球蛋白试剂国家标准品配合使用，将有助于该产品的质量提升，更好满足临床需求和市场监管。

本标准为首次制订，主要内容包括范围、规范性引用文件、术语和定义、要求、试验方法、标签和使用说明书、包装、运输、贮存、附录 A（检测所用红细胞）、附录 B（检测所用血清或血浆）、附录 C（抗人球蛋白试剂国家标准品）、参考文献。本标准编制时遵守了GB/T 1.1《标准化工作导则》系列标准确定的规则。本标准在相关技术指标的确定方面，参考了国内外相关技术文件以及目前市场上产品说明书和性能评估资料[13]，并结合临床要求着重从保障临床安全输血角度出发，在产品的特异性和灵敏度这两个关键性能指标中，不仅规定了间接抗人球蛋白试验的质量要求，同时规定了直接抗人球蛋白试验的质量要求。业内专家对逐条性能指标进行了充分讨论。并且对标准中每一条性能指标和试验方法均进行了实验验证，关键指标效价评价采用了相应的抗人球蛋白试剂国家标准品进行考察，如上所述，验证结果全部符合标准规定的要求。综上，本次制订的适用于柱凝集法的抗人球蛋白检测卡产品标准，所列技术指标是合理的，所列试验方法是可靠的、可行的。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2022.05.010

国家药品监督管理局2020年医疗器械行业标准制修订计划（I2020007-T-ZJY）

王布强，Email：15995361358@126.com；于婷，Email：yuting@nifdc.org.cn

2022-01-21