HPLC法同时测定痰热清注射液中木犀草苷和黄芩苷的含量Δ

姚文冰（广西北海食品药品检验所，北海市 536000）

痰热清注射液是国家中药二类新药，由金银花、黄芩、连翘等5味药材经提取加工制成，具有抑菌、抗病毒等功效[1]，主要用于小儿上呼吸道感染和急性肺炎的防治。目前，未见同一色谱条件下检测金银花和黄芩含量方法的文献报道，故笔者通过相应的方法学考察建立了以高效液相色谱（HPLC）法同时测定痰热清注射液中木犀草苷、黄芩苷2个指标性成分含量的方法。结果表明，所建方法简单、快速、准确，可有效用于痰热清注射液的质量控制。

1 仪器与试药

1200型HPLC仪（美国Agilent公司）；CP225D型电子天平（德国Sartorius公司）；AW-120型电子天平（西班牙COBOS公司）；SB3200S超声波清洗器（必能信超声（上海）有限公司，功率：250 W，频率：40 kHz）。

木犀草苷、黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号分别为110795-200806、110715-200514）；痰热清注射液（上海市某厂，批号：20101214、20100711、20100121）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.5%冰醋酸（B），梯度洗脱（0→30 min，10%A→70%A；30→40 min，70%A→30%A；40→45 min，30%A→10%A）；检测波长：350 nm；流速：0.8 mL·min-1；柱温：室温；进样量：供试品30µL、对照品10µL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品贮备液 精密称取经五氧化二磷减压干燥12 h以上的木犀草苷、黄芩苷对照品各适量，加入50%甲醇制成木犀草苷和黄芩苷浓度分别为40.92、19.72µg·mL-1的混合对照品贮备液，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密量取样品20 mL，置分液漏斗中，用乙酸乙酯提取5次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣用50%甲醇使溶解并转移至5 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 分别取按处方工艺制备的不含金银花、黄芩的阴性样品，照“2.2.2”项下方法制得阴性对照溶液。

2.3 专属性考察

分别吸取上述混合对照品贮备液10µL，供试品溶液、阴性对照溶液各30µL，按“2.1”项下色谱条件进样检测。结果，供试品溶液中木犀草苷、黄芩苷与杂质峰完全分离，阴性对照无干扰。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.木犀草苷；2.黄芩苷Fig1 HPLC chromatorgramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control；1.luteolin；2.baicalin

2.4 线性关系考察

取上述混合对照品贮备液适量，加50%甲醇制成木犀草苷、黄芩苷浓度分别为0.16、0.79µg·mL-1的混合对照品溶液，依次自动进样5、10、15、20、25 µL，记录峰面积。以峰面积积分值（Y）对进样量（X，µg）进行线性回归，得木犀草苷的回归方程为Y＝38.786X+0.2（r＝0.999 3，n＝5），线性范围为0.82～4.09µg；黄芩苷的回归方程为Y＝104.59X－54.037（r＝0.999 6，n＝5），线性范围为2.37～19.72 µg。

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品贮备液10µL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果，木犀草苷、黄芩苷的RSD分别为0.20%、0.92%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件于室温下0、2、4、6、8、12、24 h各进样30 µL，记录峰面积。结果，木犀草苷、黄芩苷的RSD分别为1.24%、0.56%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

取痰热清注射液（批号：20100711）适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进样测定。结果，木犀草苷、黄芩苷的平均含量分别为1.87、8.25µg·mL-1，RSD分别为1.46%、0.21%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密量取已知含量的样品（批号：20100711）10 mL，加入适量的木犀草苷、黄芩苷对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

取3批痰热清注射液适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定样品含量，结果见表2。

3 讨论

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests（n＝6）

表2 样品含量测定结果（µg·mL-1，n＝3）Tab2 Results of content determination of samples（µg·mL-1，n＝3）

3.1 检测波长的选择

黄芩苷在276 nm和318 nm波长处均有最大吸收，而木犀草苷在350 nm波长处有最大吸收，为了便于检测，选择350 nm为检测波长[2]。在此波长下检测，2种成分均有较大的响应，重复性好。

3.2 流动相的选择

试验中发现，选择甲醇-水作流动相时，混合压力明显增高；而选择乙腈-水作流动相时，乙腈的洗脱能力强，且黏度较小，柱压大小比较合适，但所得峰容易拖尾。后将乙腈-水换成乙腈-冰醋酸，所得的峰拖尾减少。再对冰醋酸的浓度进行调节（0.1%～1.0%），经过比较发现，文中所采用的色谱条件分离效果好，保留时间适宜。

3.3 提取方法的选择

试用2010年版《中国药典》（一部）HPLC法测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量对样品的处理方法[3]，加50%甲醇与70%乙醇稀释样品，超声20 min及采用中性氧化铝洗脱[3]，分离效果均不理想。故选择用乙酸乙酯提取，残渣用50%甲醇溶解的提取方法[3]。该法制备的供试品溶液所得峰形、出峰时间及分离度均可达到较好效果。

[1]高益民，王忠山.对痰热清注射液临床药学初步评价[J].首都医药，2004，11（12）：44.

[2]陈福超，李 鹏，方宝霞.HPLC法测定苦碟子注射液中木犀草素的含量[J].中国药师，2010，13（2）：220.

[3]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：205-206、159、758-759.